Towards synthesis of monoterpenes and derivatives using synthetic biology
- 作者
- Ziga Zebec, Jonathan Wilkes, Adrian J Jervis, Nigel S Scrutton, Eriko Takano, Rainer Breitling
- 单位
- SYNBIOCHEM, Manchester Institute of Biotechnology, University of Manchester, 131 Princess Street, Manchester M1 7DN, UK
- 杂志
- Current Opinion in Chemical Biology（2016）
- DOI
- 10.1016/j.cbpa.2016.06.002
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
如何利用合成生物学方法在微生物中实现单萜及其衍生物的可持续、高效生产，并建立通用的生产工具包。
研究策略
系统回顾并总结了合成生物学在单萜/单萜类化合物生产中的应用，包括新的催化模块发现、功能通路快速组装、产品多样化策略以及生产水平优化方法。关键策略包括异源表达MVA/MEP途径、GPP合酶和单萜合酶，利用组合设计和多变量统计分析（如PCA）优化通路，以及采用CRISPR-Cas9等基因组编辑工具。
核心内容
该文系统总结了合成生物学在单萜及其衍生物可持续生产中的应用进展。作者回顾了从催化模块发掘、代谢通路组装到产物多样化和产量优化的完整技术链条，重点介绍了异源表达MVA/MEP途径、工程化GPP合酶和单萜合酶、利用主成分分析指导多变量优化以及CRISPR-Cas9快速基因组编辑等策略。关键结果包括：在大肠杆菌中通过异源MVA途径和组合优化使柠檬烯产量最高达605 mg/L，主成分分析指导的优化较原始途径提高40%；在酿酒酵母中通过工程化ERG20作为GPP合酶并与桧烯合酶融合，使桧烯产量达17.5 mg/L，较野生型提高340倍；桉叶油素在酵母中产量超过1000 mg/L。此外，通过表达P450酶可将柠檬烯转化为紫苏醇，实现产物衍生化。这些结果表明，合成生物学工具已能显著提升单萜类化合物的生产效率，为构建通用生产平台和实现工业化应用奠定了基础。
创新点
综述了最新的合成生物学工具和方法，包括：利用PCA指导代谢工程优化（提高limonene产量40%）；通过工程化ERG20作为GPP合酶并融合合酶提高sabinene产量340倍；利用细胞-free系统和组合不同生物来源的酶产生非天然化合物；利用CRISPR-Cas9进行快速基因组编辑等。
研究对象（17）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | MEP | dxs | 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase | 催化 | MEP途径限速酶，过表达以提高前体IPP/DMAPP供应 |
| Escherichia coli | MEP | idi | isopentenyl diphosphate isomerase | 催化 | 过表达增强IPP和DMAPP互变 |
| Escherichia coli | MVA | MVA pathway genes (from Staphylococcus aureus and Saccharomyces cerevisiae) | MVA pathway enzymes | 催化 | 异源表达甲羟戊酸途径，补充前体供应 |
| Escherichia coli | Terpene precursor biosynthesis | GPPS | geranyl pyrophosphate synthase | 催化 | 来自Abies grandis，催化IPP和DMAPP缩合生成GPP |
| Escherichia coli | Monoterpene biosynthesis | limonene synthase | limonene synthase | 催化 | 来自Mentha spicata，催化GPP环化生成limonene |
| Escherichia coli | Monoterpene biosynthesis | pinene synthase | pinene synthase | 催化 | 来自Abies grandis，催化GPP生成α-pinene和β-pinene |
| Escherichia coli | Monoterpene biosynthesis | myrcene synthase | myrcene synthase | 催化 | 来自Quercus ilex，催化GPP生成myrcene |
| Escherichia coli | Monoterpene biosynthesis | sabinene synthase | sabinene synthase | 催化 | 来自Salvia pomifera，催化GPP生成sabinene |
| Escherichia coli | Monoterpene biosynthesis | geraniol synthase | geraniol synthase | 催化 | 来自Ocimum basilicum，催化GPP生成geraniol |
| Saccharomyces cerevisiae | Terpene precursor biosynthesis | ERG20 | farnesyl pyrophosphate synthase (engineered as GPP synthase) | 催化 | 工程化后主要产生GPP，且不能进一步生成FPP，减少竞争途径 |
| Saccharomyces cerevisiae | Monoterpene biosynthesis | sabinene synthase | sabinene synthase | 催化 | 来自Salvia pomifera，与工程化ERG20融合表达，提高sabinene产量 |
| Saccharomyces cerevisiae | Monoterpene biosynthesis | cineole synthase | cineole synthase | 催化 | 来自Salvia fruticosa，催化GPP生成cineole，产量超过1000 mg/L |
| Saccharomyces cerevisiae | Sterol biosynthesis | HMG2 | HMG-CoA reductase | 催化 | 过表达提高甲羟戊酸途径通量，增强前体供应 |
| Saccharomyces cerevisiae | MVA | IDI1 | isopentenyl diphosphate isomerase | 催化 | 过表达增强IPP和DMAPP互变 |
| Corynebacterium glutamicum | Monoterpene biosynthesis | pinene synthase | pinene synthase | 催化 | 来自Pinus taeda，合成pinene，但产量较低（0.176 mg/L） |
| Escherichia coli | Limonene hydroxylation | CYP450 (Mycobacterium sp.) | cytochrome P450 | 催化 | 将limonene羟化为perillyl alcohol，增加产品多样性 |
| Escherichia coli | Menthol biosynthesis | NtDBR, MMR, MNMR | double bond reductase, menthone reductase, neomenthol reductase | 催化 | 来自Nicotiana tabacum，用于细胞-free体系从limonene生产薄荷醇及其异构体 |
关键发现
- 通过异源MVA途径和组合优化，E. coli中limonene最高产量达605 mg/L；通过PCA指导的优化较原始途径提高40%；在S. cerevisiae中通过工程化ERG20和融合sabinene合酶，sabinene产量达17.5 mg/L，较野生型提高340倍；在S. cerevisiae中cineole产量超过1000 mg/L；其他单萜产量：α-pinene
- 4 mg/L（E. coli），myrcene
- 2 mg/L（E. coli），geraniol
- 5 mg/L（E. coli），sabinene
- 2 mg/L（E. coli）；C. glutamicum中pinene
- 176 mg/L，myrcene
- 165 mg/L；此外，通过表达P450可将limonene转化为perillyl alcohol。
研究结论
合成生物学方法在单萜/单萜类化合物生产中已取得显著进展，通过优化前体供应、合酶表达和基因组编辑，能够实现高效、可持续的生产。未来，随着计算工具、组学分析、蛋白质工程和快速基因组编辑技术的发展，将能更快速地设计和优化生产菌株，实现更多单萜及其衍生物的工业化生产。