Repeated fermentation from raw starch using Saccharomyces cerevisiae displaying both glucoamylase and \(\alpha\) -amylase
- 作者
- Syun-ichi Yamakawa, Ryosuke Yamada, Tsutomu Tanaka, Chiaki Ogino, Akihiko Kondo
- 单位
- Department of Chemical Science and Engineering, Graduate School of Engineering, Kobe University; Organization of Advanced Science and Technology, Kobe University
- 杂志
- Enzyme and Microbial Technology（2012）
- DOI
- 10.1016/j.enzmictec.2012.03.005
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何实现生淀粉直接发酵生产乙醇，并在重复批次发酵中保持淀粉酶活性，从而降低生物乙醇生产成本。
研究策略
通过细胞表面共展示α-淀粉酶和葡糖淀粉酶，对α-淀粉酶进行结构优化（添加底物结合域），构建二倍体菌株并导入麦芽糖转运蛋白AGT1，以实现高效稳定的重复发酵。
核心内容
该研究针对生淀粉直接发酵生产乙醇时淀粉酶活性不稳定、成本高的问题，在酿酒酵母细胞表面共展示α-淀粉酶和来自米根霉的葡糖淀粉酶，并对α-淀粉酶进行结构优化，在其N端添加底物结合域，获得修饰型淀粉酶SBAI；进一步构建二倍体菌株并导入麦芽糖转运蛋白AGT1，以增强麦芽糖利用能力。在200 g/l生玉米淀粉发酵120 h时，展示SBAI的菌株产乙醇46.5 g/l，为展示天然α-淀粉酶菌株（30.9 g/l）的1.5倍；二倍体菌株MNII/6GSBAIAG/405产乙醇77.6 g/l（理论产率76.8%），导入AGT1后产乙醇提升至88.9 g/l（理论产率88.0%），α-淀粉酶和葡糖淀粉酶活性分别达2486 U/l和749 U/l。在100 g/l生淀粉条件下重复批次发酵23个循环，平均乙醇生产率为1.61 g/l/h，平均产率为理论值的76.6%，且酶活未下降。结果表明，该共展示修饰α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的二倍体酵母可在重复发酵中稳定高效转化生淀粉为乙醇，具有降低生物乙醇生产成本的工业应用潜力。
创新点
['首次在酵母细胞表面共展示α-淀粉酶和葡糖淀粉酶', '通过N端添加底物结合域改造α-淀粉酶（SBAI），提高其降解生淀粉的活性', '实现了23次重复批次发酵而不损失淀粉酶活性，乙醇生产率稳定']
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae MT8-1/6GSBAIAG | 生淀粉降解与乙醇发酵 | SBAI | 修饰型α-淀粉酶 | 催化 | 在天然α-淀粉酶N端添加底物结合域，活性高于天然酶，120 h乙醇产量46.5 g/l。 |
| Saccharomyces cerevisiae MNII/6GSBAIAG/405 | 生淀粉降解与乙醇发酵 | 葡糖淀粉酶基因（来自Rhizopus oryzae） | 葡糖淀粉酶 | 催化 | 与α-淀粉酶共展示于细胞表面，二倍体菌株乙醇产量77.6 g/l。 |
| Saccharomyces cerevisiae MNII/6GSBAIAG/405/pIHPHAGT1 | 麦芽糖转运与乙醇发酵 | AGT1 | 麦芽糖转运蛋白 | 转运 | 导入麦芽糖转运蛋白后，乙醇产量提高至88.9 g/l，α-淀粉酶活性增强至2486 U/l。 |
| Saccharomyces cerevisiae 表面展示菌株 | 细胞表面展示 | SAG1（α-凝集素编码基因） | α-凝集素锚定蛋白 | 区室化 | 用于将α-淀粉酶和葡糖淀粉酶锚定在酵母细胞表面。 |
| Saccharomyces cerevisiae MT8-1/pUPGCSBAAG | 生淀粉降解与乙醇发酵 | SBA（天然α-淀粉酶基因） | 天然α-淀粉酶 | 催化 | 未修饰的α-淀粉酶，120 h乙醇产量30.9 g/l，活性较低。 |
关键发现
- 改造后的α-淀粉酶SBAI展示菌株在200 g/l生玉米淀粉发酵120 h产乙醇46.5 g/l，为天然α-淀粉酶菌株（30.9 g/l）的1.5倍
- 二倍体菌株MNII/6GSBAIAG/405产乙醇77.6 g/l（理论产率76.8%），进一步导入AGT1后产乙醇88.9 g/l（理论产率88.0%），α-淀粉酶和葡糖淀粉酶活性分别提高至2486 U/l和749 U/l
- 在100 g/l生淀粉重复发酵23个循环中，平均乙醇生产率为1.61 g/l/h，平均产率为理论值的76.6%，总产率69.6%，且酶活未下降。
研究结论
构建的共展示修饰α-淀粉酶和葡糖淀粉酶的二倍体酵母菌株能够在重复批次发酵中稳定高效地将生淀粉转化为乙醇，且酶活不损失，具有工业应用潜力，可降低生物乙醇生产成本。