Comparative performance of S-adenosyl-L-methionine biosynthesis and degradation in Pichia pastoris using different promoters and novel consumption inhibitors

作者: Xiaoqing Hu, Ju Chu, Siliang Zhang, Yingping Zhuang
单位: Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education, and State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China; State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China
杂志: Enzyme and Microbial Technology（2013）
DOI: 10.1016/j.enzmictec.2013.09.003
所属领域: 代谢工程
关键词: BiosynthesisConstitutive promoterConsumptionInducible promoterPichia pastorisS-adenosyl-L-methionine
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解决的核心问题

比较诱导型启动子PAOX和组成型启动子PGAP驱动的巴斯德毕赤酵母在S-腺苷-L-甲硫氨酸(SAM)生物合成与降解方面的性能差异，并开发抑制SAM降解的新策略以提高SAM积累。

研究策略

分别构建由PAOX和PGAP启动子驱动mat基因过表达的两种毕赤酵母菌株，比较其SAM合成酶转录、活性、生长、ATP、SAM及相关代谢物水平；基于代谢差异，使用aristeromycin抑制SAM向谷胱甘肽转化，使用乙醇抑制SAM向亚精胺转化，从而减少SAM消耗，提高SAM产量。

研究路线图

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核心内容

研究通过比较诱导型启动子PAOX与组成型启动子PGAP驱动的甲硫氨酸腺苷转移酶（MAT）过表达，系统探究了巴斯德毕赤酵母在S-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM）合成与降解方面的性能差异。结果显示，PGAP菌株的mat转录水平为PAOX菌株的3.46倍，MAT活性峰值达8.60 U/g DCW（约为PAOX菌株的两倍），生物量达181 g/L；然而PAOX菌株的SAM积累量更高，达到10.75 g/L（比PGAP高18.26%），但PGAP菌株的SAM产率（0.14 g/L/h）比PAOX高40%。代谢分析表明，PAOX菌株因甲醇诱导产生氧化应激，促使更多SAM流向谷胱甘肽合成（GSH+GSSG/SAM比值从0.31升至0.77），而PGAP菌株因快速生长，SAM更多流向亚精胺合成。针对这两条降解途径，研究分别添加新型抑制剂aristeromycin（抑制谷胱甘肽合成）和乙醇（抑制亚精胺合成），使PAOX菌株SAM积累提高至11.83 g/L，PGAP菌株SAM产率提升54.55%至0.17 g/L/h。该工作揭示了不同启动子背景下SAM代谢流分配的生理差异，并提供了选择性抑制SAM降解以提升产量的有效策略。

创新点

首次系统比较诱导型与组成型启动子在毕赤酵母全细胞生物催化中的生理差异；发现aristeromycin和乙醇作为新型SAM降解抑制剂，分别抑制谷胱甘肽和亚精胺合成途径，显著提高SAM积累和产率。

研究对象（4）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Pichia pastoris	SAM生物合成	mat	甲硫氨酸腺苷转移酶(MAT)	催化	受PAOX或PGAP启动子控制，用于SAM合成
Pichia pastoris	SAM降解-转硫途径（谷胱甘肽合成）	—	SAH水解酶	催化	aristeromycin抑制其活性以减少SAM转化为谷胱甘肽
Pichia pastoris	基因表达调控	PAOX启动子	—	调控	甲醇诱导型启动子
Pichia pastoris	基因表达调控	PGAP启动子	—	调控	组成型启动子

关键发现

组成型启动子PGAP菌株的mat转录水平是诱导型PAOX菌株的3.46倍，MAT活性峰值(8.60 U/g DCW)约为PAOX菌株(4.26 U/g DCW)的2倍
MAT含量分别为16.63和7.91 mg/g DCW。PGAP菌株生物量达181 g/L，比PAOX菌株(149 g/L)高21.48%
但PAOX菌株SAM积累达10.75 g/L，比PGAP菌株高18.26%
然而PGAP菌株SAM产率为0.14 g/L/h，比PAOX菌株高40%。PAOX菌株中(GSH+GSSG)/SAM比值从0.31升至0.77，而PGAP菌株稳定在0.25-0.26
PAOX菌株H2O2在甲醇诱导后10h升至210 μmol/g，65h后再次升至230 μmol/g。PGAP菌株SPD/SAM比值最高达1.90%，PAOX菌株仅0.42%。添加0.02 mg/L aristeromycin使PAOX菌株(GSH+GSSG)/SAM比值从7.7%降至4.9%，SAM积累提高7.74%至11.83 g/L。添加8 g/L乙醇使PGAP菌株SPD/SAM比值从1.9%降至0.5%，SAM产量从9.09 g/L升至10.98 g/L，SAM产率提高54.55%至0.17 g/L/h。

研究结论

采用PAOX和PGAP启动子的毕赤酵母在SAM合成与降解上存在显著生理差异：PAOX菌株因甲醇代谢产生的氧化应激，更多SAM流向谷胱甘肽合成；PGAP菌株因快速生长，更多SAM流向亚精胺合成。通过aristeromycin和乙醇分别抑制SAM向谷胱甘肽和亚精胺的转化，可有效提高SAM积累。PAOX菌株SAM积累达11.83 g/L，PGAP菌株SAM产率达0.17 g/L/h。