Cellulosic ethanol production by combination of cellulase-displaying yeast cells
- 作者
- Seung-Ho Baek, Sujin Kim, Kyusung Lee, Jung-Kul Lee, Ji-Sook Hahn
- 单位
- School of Chemical and Biological Engineering, Seoul National University; Department of Chemical Engineering, Konkuk University
- 杂志
- Enzyme and Microbial Technology（2012）
- DOI
- 10.1016/j.enzmictec.2012.08.005
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
开发适合酵母表面展示的内切葡聚糖酶，并构建组合细胞系统高效生产纤维素乙醇，解决单一细胞共展示多种纤维素酶导致的代谢负担和表达优化困难问题。
研究策略
在酿酒酵母表面分别展示多种真菌和细菌内切葡聚糖酶，比较其酶学性质；选择热子囊菌EGI与里氏木霉CBHII、黑曲霉BGLI组合，将三种分别展示不同纤维素酶的酵母细胞以优化比例混合，实现纤维素乙醇生产。
核心内容
针对单一酵母细胞共展示多种纤维素酶带来的代谢负担与优化难题，该研究在酿酒酵母EBY100表面分别展示了来自真菌和细菌的多种内切葡聚糖酶，系统比较了其酶学性质。结果显示，里氏木霉EGII在除pH9外的整体范围内CMC降解活性最高，而热子囊菌EGI对PASC的活性优于EGII；真菌酶的表面表达水平普遍高于细菌酶，其中EGI表达量最高，细菌CelD在测试条件下无PASC水解活性。在此基础上，采用“一细胞一酶”的组合策略，将分别展示EGI、CBHII和BGLI的三种酵母按优化比例混合，以10 g/L PASC为底物发酵85小时，当EGI:CBHII:BGLI比例为6:2:1时乙醇产量达2.12 g/L，较等比例混合的1.65 g/L提高约1.3倍。该策略通过调整细胞比例即可灵活优化混合酶系，避免了共展示的代谢负担，为整合生物加工中纤维素乙醇的高效生产提供了可扩展的技术路径。
创新点
1. 首次在酵母表面直接表达并比较了Thermoascus aurantiacus EGI、Clostridium thermocellum CelA/CelD等内切葡聚糖酶的性质；2. 采用“一细胞一酶”的组合策略，通过调整细胞比例优化混合酶系，避免共展示造成的代谢负担，便于灵活扩展和优化。
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae EBY100 | 纤维素降解与乙醇发酵 | EGI | Thermoascus aurantiacus EGI | 催化 | 内切葡聚糖酶，在酵母表面展示，对PASC水解活性较好，用于组合系统 |
| Saccharomyces cerevisiae EBY100 | 纤维素降解与乙醇发酵 | EGII | Trichoderma reesei EGII | 催化 | 内切葡聚糖酶，CMC降解活性高，作为对照和候选酶 |
| Saccharomyces cerevisiae EBY100 | 纤维素降解与乙醇发酵 | CelA | Clostridium thermocellum CelA | 催化 | 内切葡聚糖酶，细菌来源，最适温度70°C，含dockerin结构域 |
| Saccharomyces cerevisiae EBY100 | 纤维素降解与乙醇发酵 | CelD | Clostridium thermocellum CelD | 催化 | 内切葡聚糖酶，细菌来源，最适温度50°C，对PASC无水解活性 |
| Saccharomyces cerevisiae EBY100 | 纤维素降解与乙醇发酵 | CBHII | Trichoderma reesei CBHII | 催化 | 外切葡聚糖酶（纤维二糖水解酶），与EGI协同水解PASC |
| Saccharomyces cerevisiae EBY100 | 纤维素降解与乙醇发酵 | BGLI | Aspergillus aculeatus BGLI | 催化 | β-葡萄糖苷酶，将纤维二糖转化为葡萄糖，供酵母利用 |
| Saccharomyces cerevisiae EBY100 | 纤维素降解与乙醇发酵 | AGA2 | Aga2p | 区室化 | 酵母表面展示锚定蛋白，通过二硫键与Aga1p连接，将纤维素酶固定在细胞表面 |
关键发现
- T. reesei EGII在整体pH范围（除pH9外）具有最高的CMC降解活性，最适pH约3-4
- EGI在PASC上活性优于EGII。表面表达水平以EGI最高（100%），EGII为96%，CelA为90%，CelD为71%。以10 g/L PASC为底物，优化EGI:CBHII:BGLI比例为6:2:1时，发酵85 h乙醇产量达2.12 g/l，比等比例混合（1.65 g/l）提高约1.3倍。细菌EG（CelA/CelD）对PASC降解活性低，CelD在测试条件下无PASC水解活性。真菌EG在酵母表面的表达水平普遍高于细菌EG。
研究结论
成功建立了一种通过组合三种分别展示EGI、CBHII和BGLI的酵母细胞系统，通过优化细胞比例实现纤维素乙醇高效生产，该策略可灵活扩展更多纤维素酶，有望用于整合生物加工（CBP）。