Inactivation of hydrogenase- 3 leads to enhancement of 1,3- propanediol and 2,3- butanediol production by Klebsiella pneumoniae
- 作者
- Weiyan Jiang, Yaoyu Cai, Shaoqi Sun, Wenqi Wang, Marina Tišma, Frank Baganz, Jian Hao
- 单位
- Lab of Biorefinery, Shanghai Advanced Research Institute, Chinese Academy of Sciences; Department of Biochemical Engineering, University College London; Josip Juraj Strossmayer University of Osijek, Faculty of Food Technology Osijek; University of Chinese Academy of Sciences
- 杂志
- Enzyme and Microbial Technology（2024）
- DOI
- 10.1016/j.enzmictec.2024.110438
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过代谢工程提高肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）生产1,3-丙二醇和2,3-丁二醇的效率，特别是通过调控与目标产物无直接代谢关联的氢化酶-3来改善胞内氧化还原平衡。
研究策略
通过Red重组酶系统敲除氢化酶-3编码基因hycEFG，阻断甲酸产氢途径；进一步组合敲除乳酸脱氢酶基因ldhA和乙醇脱氢酶基因adhE，在厌氧和微好氧条件下分别以甘油和葡萄糖为底物进行发酵，分析目标产物及副产物变化。
核心内容
该研究通过Red重组酶系统在肺炎克雷伯氏菌CGMCC 1.6366中敲除氢化酶-3编码基因hycEFG，阻断甲酸产氢途径，并进一步组合敲除ldhA和adhE，考察不同碳源及供氧条件下目标产物积累的变化。以甘油为碳源时，ΔhycEFG菌株虽生长减慢，但1,3-丙二醇转化率从野生型的0.59 mol/mol提升至0.66 mol/mol，且完全不产H2；微好氧条件下，ΔldhAΔhycEFG双敲菌株产1,3-丙二醇16.61 g/L，转化率达0.63 mol/mol，显著高于野生型的0.55 mol/mol。以葡萄糖为碳源时，ΔhycEFG菌株厌氧产2,3-丁二醇6.47 g/L，转化率0.57 mol/mol，高于野生型的5.68 g/L和0.47 mol/mol；微好氧条件下，ΔldhAΔadhEΔhycEFG三敲菌株产2,3-丁二醇8.95 g/L，转化率0.73 mol/mol，较野生型提高约45%。研究证实氢化酶-3失活可提高胞内NADH/NAD+比值，促进还原性产物积累，为工业菌株构建提供了新策略。
创新点
首次在肺炎克雷伯氏菌中敲除氢化酶-3编码基因hycEFG，证实失活氢化酶-3能阻断H2生成并提高NADH/NAD+比值，从而促进还原性产物1,3-丙二醇和2,3-丁二醇的积累；发现氢化酶-3失活对细胞全局代谢调控具有正效应，为构建高效工业菌株提供新策略。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Klebsiella pneumoniae CGMCC 1.6366 | 甲酸氢裂解酶途径（H2产生） | hycEFG | 氢化酶-3 | 催化 | 敲除后完全阻断H2生成，甲酸积累增加，NADH/NAD+比值升高 |
| Klebsiella pneumoniae | 乳酸合成 | ldhA | 乳酸脱氢酶 | 催化 | 敲除后乳酸产量显著降低，有利于1,3-丙二醇和2,3-丁二醇积累 |
| Klebsiella pneumoniae | 乙醇合成 | adhE | 乙醇脱氢酶 | 催化 | 敲除后乙醇产量降至0.10 g/L，但对1,3-丙二醇影响复杂 |
| Klebsiella pneumoniae | 1,3-丙二醇合成（dha操纵子） | dhaBCE, dhaT, dhaD, dhaK | 甘油脱水酶、1,3-丙二醇脱氢酶、甘油脱氢酶、磷酸二羟丙酮激酶 | 催化 | 目标产物合成途径，受NADH/NAD+比值影响 |
| Klebsiella pneumoniae | 2,3-丁二醇合成 | budA, budB | 乙酰乳酸脱羧酶、乙酰乳酸合成酶 | 催化 | 葡萄糖底物下的主要目标产物途径，氢化酶-3失活后产量提高 |
| Klebsiella pneumoniae | 丙酮酸代谢 | pflB | 丙酮酸甲酸裂解酶 | 催化 | 相关前期研究，pflB敲除可提高NADH生成，本文未直接操作 |
关键发现
- 以甘油为碳源时，野生型菌株在11小时消耗28.30 g/L甘油并产生13.91 g/L 1,3-丙二醇，转化率0.59 mol/mol
- ΔhycEFG菌株虽生长减慢，但24小时消耗25.86 g/L甘油产生14.21 g/L 1,3-丙二醇，转化率升至0.66 mol/mol，且完全不产H2，甲酸积累1.96 g/L。微好氧条件下，ΔhycEFG菌株产1,3-丙二醇16.14 g/L，转化率0.59 mol/mol，甲酸产量较野生型提高37%
- ΔldhAΔhycEFG双敲菌株进一步产1,3-丙二醇16.61 g/L，转化率0.63 mol/mol（摘要中为0.628 mol/mol），显著高于野生型的0.55 mol/mol（摘要中为0.545 mol/mol）
- 而ΔldhAΔadhEΔhycEFG三敲菌株反而降至14.87 g/L，转化率0.57 mol/mol。以葡萄糖为碳源时，ΔhycEFG菌株厌氧产2,3-丁二醇6.47 g/L，转化率0.57 mol/mol，高于野生型的5.68 g/L和0.47 mol/mol
- 微好氧条件下，ΔldhAΔadhEΔhycEFG菌株产2,3-丁二醇8.95 g/L，转化率0.73 mol/mol（摘要中为0.730 mol/mol），较野生型（6.32 g/L，0.50 mol/mol）提高44.74%。此外，乳酸副产物在ΔldhA和ΔldhAΔhycEFG中分别降至0.88 g/L和0.52 g/L，低于野生型的1.37 g/L。NADH/NAD+比值在hycEFG敲除菌株中升高。
研究结论
失活氢化酶-3可阻断肺炎克雷伯氏菌的H2生成途径，增加胞内NADH/NAD+比值，从而显著提高1,3-丙二醇和2,3-丁二醇的产量及底物转化率；该策略可能通过影响细胞全局代谢调控发挥作用，为工业上利用甘油和葡萄糖生产大宗化学品提供了新途径。