高级醇 · 代谢工程文献库

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fldA is an essential gene required in the 2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate pathway for isoprenoid biosynthesis

作者
Kia-Joo Puan, Hong Wang, Tohru Dairi, Tomohisa Kuzuyama, Craig T. Morita
单位
Division of Rheumatology, Department of Internal Medicine and the Interdisciplinary Group in Immunology, University of Iowa, EMRB 340F, Iowa City, IA 52242, USA; Biotechnology Research Center, Toyama Prefectural University, Toyama 939-0398, Japan; Biotechnology Research Center, The University of Tokyo, Bunkyo-ku, Tokyo 113-8657, Japan
杂志
FEBS Letters（2005）
DOI
10.1016/j.febslet.2005.05.047
所属领域
代谢工程
关键词
(E)-4-Hydroxy-3-methylbutyl-2-enyl pyrophosphate2-C-Methyl-D-erythritol 4-phosphateFlavodoxin IfldAγδ T cell
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解决的核心问题

鉴定大肠杆菌中flavodoxin I（fldA）必需的确切代谢途径

研究策略

利用转座子诱变筛选不能独立于甲羟戊酸生长的大肠杆菌突变体，结合lytB点突变和甲羟戊酸途径回补，鉴定fldA基因；通过基因回补验证表型，并利用γδ T细胞生物活性检测HMBPP水平，确定flavodoxin I的作用位点

研究路线图

100%
研究问题：鉴定fldA必需代谢途径
策略：转座子诱变筛选突变体
关键改造：鉴定fldA基因与功能回补
结果：fldA突变导致HMBPP下降
结论：flavodoxin I为GcpE/LytB供电子
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核心内容

该研究利用转座子诱变筛选，在大肠杆菌中鉴定出fldA基因是MEP途径中类异戊二烯生物合成所必需的基因。通过对27个不能独立于甲羟戊酸生长的突变体进行分析，发现25个突变插入MEP途径基因，另1个为fldA基因，插入位点位于编码序列第39位核苷酸。fldA突变体在缺乏甲羟戊酸时无法生长，补充甲羟戊酸后恢复生长，回补fldA后虽可恢复无甲羟戊酸生长但速度较慢。在LytB突变菌株中，HMBPP过量积累，其γδ T细胞生物活性比野生型高436倍；fldA突变后生物活性降至野生型水平。研究首次证明flavodoxin I在大肠杆菌中的必需作用是为MEP途径中GcpE（可能还有LytB）的[4Fe-4S]簇提供还原当量，缺失该蛋白将导致MEP途径受阻，类异戊二烯前体无法合成，揭示了flavodoxin I的生理功能。

创新点

首次证明flavodoxin I在大肠杆菌中的必需作用是参与MEP途径，为GcpE（可能还有LytB）的[4Fe-4S]簇提供还原当量，从而支持类异戊二烯生物合成

研究对象（5）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
大肠杆菌 Escherichia coli MEP途径 fldA Flavodoxin I 能量供给 为GcpE和LytB的[4Fe-4S]簇提供还原当量
大肠杆菌 Escherichia coli MEP途径 gcpE (ispG) GcpE (IspG) 催化 催化合成HMBPP，含[4Fe-4S]簇
大肠杆菌 Escherichia coli MEP途径 lytB (ispH) LytB (IspH) 催化 催化HMBPP转化为IPP和DMAPP，含[4Fe-4S]簇
大肠杆菌 Escherichia coli 类异戊二烯生物合成 idi 异戊烯基焦磷酸异构酶 催化 催化IPP和DMAPP互变，在DK310中被敲除
大肠杆菌 Escherichia coli 甲羟戊酸途径 MVK, PMK, MDD（来自Streptomyces sp. CL190） 甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶 催化 导入用于回补研究

关键发现

  1. 通过转座子诱变筛选，从27个不能独立于甲羟戊酸生长的突变体中发现25个插入MEP途径基因，另1个为fldA基因（插入位点为编码序列第39位核苷酸）。fldA突变体在无甲羟戊酸时不能生长，供甲羟戊酸时可生长，回补fldA后恢复无甲羟戊酸生长但生长较慢。在DK310 LytB^{G120D}(pTMV20KM)菌株中，HMBPP过量积累，其γδ T细胞生物活性比野生型高436倍
  2. 而fldA突变后生物活性降至野生型水平，对应HMBPP分别为0.6、250.3和0.7 μmol（单位活性对应31.6 pM HMBPP）。fldA突变体生物活性仍高于gcpE转座子突变体（<500和1044 U/L）及gcpE缺失突变体，提示GcpE仍有残留活性。

研究结论

Flavodoxin I在大肠杆菌中的必需作用是在MEP途径中为GcpE（可能还有LytB）的铁硫簇提供还原当量，缺少flavodoxin I将导致MEP途径受阻，类异戊二烯前体无法合成；该研究揭示了flavodoxin I的生理功能。