A single desaturase gene from red yeast Sporidiobolus pararoseus is responsible for both four- and five-step dehydrogenation of phytoene
- 作者
- Chunji Li, Ning Zhang, Jia Song, Na Wei, Bingxue Li, Hongtao Zou, Xiaori Han
- 单位
- College of Land and Environment, Shenyang Agricultural University; College of Biological Science and Technology, Shenyang Agricultural University
- 杂志
- Gene（2016）
- DOI
- 10.1016/j.gene.2016.06.042
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
红酵母Sporidiobolus pararoseus中类胡萝卜素生物合成相关基因特别是八氢番茄红素脱氢酶基因的功能尚不明确，需要克隆并鉴定该基因的催化特性。
研究策略
从S. pararoseus CGMCC 2.5280中克隆crtI基因的基因组DNA和cDNA，构建大肠杆菌异源表达和互补系统，结合TLC、HPLC和MS分析产物以确定脱氢步骤。
核心内容
该研究从红酵母Sporidiobolus pararoseus CGMCC 2.5280中克隆了类胡萝卜素合成关键基因crtI的基因组DNA和cDNA，并在大肠杆菌中通过异源表达和功能互补实验鉴定了其编码的八氢番茄红素脱氢酶的催化特性。序列分析显示该基因cDNA全长1683 bp，编码560个氨基酸，预测分子量62.28 kDa，与粗糙脉孢菌Al-1的一致性为45.80%。功能实验表明，该酶不仅能催化八氢番茄红素经四步脱氢生成番茄红素（m/z 536.43804），还能进行五步脱氢生成3,4-二氢番茄红素（m/z 534.42349），这是首次报道单个CrtI酶同时具有四步和五步脱氢活性。在共表达crtE和crtB提供底物的大肠杆菌中，异源表达crtI使菌落由无色变为红色，HPLC与TLC结果与预期产物一致。这一发现为类胡萝卜素的微生物工程化合成提供了新的基因来源，拓宽了可利用的脱氢酶催化功能类型。
创新点
首次报道S. pararoseus中单个crtI基因编码的八氢番茄红素脱氢酶同时催化四步和五步脱氢反应，分别生成番茄红素和3,4-二氢番茄红素，为类胡萝卜素工程化合成提供了新的基因来源。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Sporidiobolus pararoseus CGMCC 2.5280 | 类胡萝卜素生物合成 | crtI | CrtI（八氢番茄红素脱氢酶） | 催化 | 克隆自该菌株，基因编码560个氨基酸蛋白，同时催化四步和五步脱氢生成番茄红素和3,4-二氢番茄红素 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 外源类胡萝卜素合成途径 | crtI | CrtI（八氢番茄红素脱氢酶） | 催化 | 通过pET30a-crtI异源表达，用于功能验证，可催化八氢番茄红素转化为番茄红素及3,4-二氢番茄红素 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 类胡萝卜素前体合成（八氢番茄红素供给） | crtE, crtB | GGPP合酶、八氢番茄红素合酶 | 催化 | 来自Erwinia herbicola，通过pAC-LYCΔ(crtI)质粒提供八氢番茄红素底物，用于检测S. pararoseus CrtI活性 |
关键发现
- crtI基因组DNA全长2330 bp，cDNA全长1683 bp，编码560个氨基酸的蛋白，预测分子量62.28 kDa，等电点7.27；与Neurospora crassa Al-1的氨基酸序列一致性为45.80%；功能互补实验表明该酶能催化八氢番茄红素经四步脱氢生成番茄红素（m/z
- 43804），并经五步脱氢生成3,4-二氢番茄红素（m/z
- 42349）；大肠杆菌中异源表达后菌落颜色发生相应变化（无色→红色、淡黄→红色、粉红→红色），HPLC和TLC结果与预期产物一致。
研究结论
S. pararoseus的crtI基因编码一个同时具有四步和五步脱氢活性的八氢番茄红素脱氢酶，可作为构建工程化类胡萝卜素合成途径的替代基因来源。