An enhanced protein–protein interaction based on enzymatic complex through replacement of the recognition site
- 作者
- Sang Duck Jeon, Su Jung Kim, Sung Hyun Park, Gi- Wook Choi, Sung Ok Han
- 单位
- Department of Biotechnology, Korea University, Seoul 136- 701, Republic of Korea; Changha Advanced Institute of Technology, Changha Ethanol Co., Ltd., Jeonju 561- 203, Republic of Korea
- 杂志
- International Journal of Biological Macromolecules（2015）
- DOI
- 10.1016/j.ijbiomac.2015.01.018
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
通过替换C. cellulovorans纤维素酶复合物（cellulosome）中dockerin模块的识别位点氨基酸，研究其对cohesin-dockerin相互作用亲和力的影响，并利用该策略提高基于cohesin的生物标记在蛋白质组学检测中的灵敏度。
研究策略
采用定点突变技术将EngE、EngH和ExgS的dockerin模块第11和12位氨基酸替换为Al、SL或SM基序，结合荧光标记cohesin生物标记物进行2D-PAGE分析，并通过ELIA、cELIA和SPR定量评估突变对结合亲和力的影响。
核心内容
该研究通过定点突变系统改造C. cellulovorans纤维素酶复合物中dockerin模块第11和12位氨基酸，将其替换为Al、SL或SM基序，以探究cohesin-dockerin相互作用的特异性决定位点，并利用该策略提升基于cohesin的生物标记在蛋白质组学检测中的灵敏度。研究采用荧光标记cohesin生物标记物进行2D-PAGE分析，结合ELIA、cELIA和SPR定量评估突变对结合亲和力的影响。关键结果显示，EngE Al和EngH Al突变体与Coh2/Coh9的结合分别增强1.4-2.2倍，EngE Al对Coh9的亲和力提高约2.0倍；SPR测定中EngE Al与Coh2的KD为2.49×10^-9 M，比野生型高约31倍，EngH Al与Coh9的KD为3.71×10^-9 M，约高16倍；cELIA显示EngE Al和EngH Al与Coh9的结合效率达80-85%，而ExgS SM突变体结合效率仅12%。研究首次系统证明第11和12位氨基酸是决定cohesin选择性的关键位点，通过替换可显著调节蛋白质-蛋白质相互作用，为基于cohesin的高灵敏性生物标记和酶联分析方法提供了新策略。
创新点
首次系统地证明dockerin模块第11和12位氨基酸残基是决定C. cellulovorans细胞ulosome中cohesin选择性的关键位点，通过替换相应残基可显著增强或减弱蛋白质-蛋白质相互作用，并开发了灵敏度提高的cohesin生物标记系统。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 纤维素降解/细胞ulosome组装 | engE | EngE | 催化 | 内切葡聚糖酶E，dockerin第11/12位由SL突变为Al（EngE Al），增强与Coh2/Coh9结合 |
| Escherichia coli | 纤维素降解/细胞ulosome组装 | engH | EngH | 催化 | 内切葡聚糖酶H，dockerin第11/12位由SM突变为Al（EngH Al）或SL（EngH SL），增强与Coh9结合 |
| Escherichia coli | 纤维素降解/细胞ulosome组装 | exgS | ExgS | 催化 | 外切葡聚糖酶S，dockerin第11/12位由Al突变为SM（ExgS SM），降低与Coh2/Coh9结合 |
| Escherichia coli | 纤维素降解/细胞ulosome组装 | cbpA | Coh2 | 区室化 | 脚手架蛋白CbpA的cohesin模块2，与dockerin相互作用形成细胞ulosome |
| Escherichia coli | 纤维素降解/细胞ulosome组装 | cbpA | Coh9 | 区室化 | 脚手架蛋白CbpA的cohesin模块9，与增强型EngE Al/EngH Al结合亲和力提高 |
| Escherichia coli | 纤维素降解/细胞ulosome组装 | cbpA | CbpA | 区室化 | 含多个cohesin模块的脚手架蛋白，负责组装细胞ulosomal酶 |
关键发现
- 荧光强度分析显示，EngE Al和EngH Al突变体与Coh2/Coh9的结合分别增强1.4-2.2倍，而ExgS SM突变体结合降低0.6-0.7倍
- ELIA显示EngE Al对Coh2和Coh9的亲和力提高约2.0倍，EngH Al对Coh9提高1.9倍，ExgS SM对Coh9降低2.2倍
- cELIA显示EngE Al和EngH Al与Coh9的结合效率达80-85%（野生型约50%），ExgS SM仅12%
- SPR测定EngE Al与Coh2的KD为2.49×10^-9 M（比野生型7.62×10^-8 M高约31倍），EngH Al与Coh9的KD为3.71×10^-9 M（比野生型6.12×10^-8 M高约16倍），EngH SL与Coh9的KD为5.23×10^-9 M（高约12倍），ExgS SM与Coh9的KD为4.18×10^-7 M（比野生型4.98×10^-9 M降低约84倍）。
研究结论
改变dockerin模块第11和12位氨基酸可有效调节与特定cohesin的结合亲和力，证明C. cellulovorans脚手架蛋白中的某些cohesin对细胞ulosomal酶存在选择性结合，同时通过替换识别位点可增强蛋白质-蛋白质相互作用，为基于cohesin的生物标记和酶联分析方法提供了灵敏性改进策略。