Combined effect of the methanol utilization (Mut) phenotype and gene dosage on recombinant protein production in Pichia pastoris fed-batch cultures
- 作者
- Oriol Cos, Alicia Serrano, José Luis Montesinos, Pau Ferrer, James M. Cregg, Francisco Valero
- 单位
- Departament d'Enginyeria Química, ETSE, Universitat Autònoma de Barcelona; Keck Graduate Institute of Applied Life Sciences
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2005）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2004.12.010
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
基因剂量和甲醇利用（Mut）表型对毕赤酵母重组蛋白生产的联合影响尚未被系统研究
研究策略
构建四种组合菌株（Mut+与Muts，ROL单拷贝与多拷贝），在补料分批培养中比较生长、甲醇消耗、脂肪酶产量及生产率
研究路线图
核心内容
本研究系统考察了毕赤酵母中甲醇利用（Mut）表型与ROL基因剂量对重组脂肪酶生产的联合影响。作者构建了四种组合菌株，包括Mut+与Muts背景下的ROL单拷贝和多拷贝菌株，并在补料分批培养中比较了生长、甲醇消耗、脂肪酶产量及生产率。结果显示，Muts单拷贝菌株的比生产率和单位细胞产率（YP/X）分别比Mut+单拷贝菌株高1.29倍和2.34倍；但Mut+单拷贝菌株因培养周期更短，体积生产率反而高出1.34倍（3000对2246 UA/l/h）。基因剂量增加在两种表型中均造成细胞代谢负担，导致体积生产率下降约1.5至1.6倍，且多拷贝Muts菌株（含23至24个ROL拷贝）在培养约10小时后代谢活性显著降低，无法持续生产。此外，Muts菌株比生长速率均低于0.02 h-1，显著慢于Mut+菌株。这些结果说明，Muts菌株在单位细胞产率上具有优势且残余甲醇浓度易控制，适合过程调控；而Mut+菌株凭借短培养周期实现更高体积产率。基因剂量并非越高越好，过量拷贝对细胞生理的负面影响限制了其应用潜力，菌株设计需在表型与基因剂量间权衡。
创新点
首次在同一异源蛋白（ROL）上同时考察基因剂量和Mut表型的联合效应；建立了高拷贝Muts菌株并完成组氨酸营养缺陷回复
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris X-33 | 甲醇利用通路（Mut+） | AOX1, AOX2 | 醇氧化酶 | 催化 | AOX1负责90%以上醇氧化酶活性，AOX2负责少于10% |
| Pichia pastoris GS115 | 甲醇利用通路 | his4 | — | 调控 | his4为组氨酸营养缺陷标记，用于筛选和构建回复菌株 |
| Pichia pastoris KM71 | 甲醇利用通路（Muts） | aox1Δ::SARG4, AOX2 | 醇氧化酶2 | 催化 | AOX1缺失，甲醇利用缓慢（Muts表型） |
| Pichia pastoris X-33/ROL | 甲醇利用通路 | ROL（单拷贝） | Rhizopus oryzae脂肪酶 | 催化 | Mut+单拷贝ROL分泌表达菌株 |
| Pichia pastoris X-33/500_3/ROL | 甲醇利用通路 | ROL（多拷贝） | Rhizopus oryzae脂肪酶 | 催化 | Mut+多拷贝ROL菌株，与Muts多拷贝拷贝数同数量级 |
| Pichia pastoris KM100.0/ROL | 甲醇利用通路 | ROL（单拷贝） | Rhizopus oryzae脂肪酶 | 催化 | Muts单拷贝ROL菌株（KM71来源） |
| Pichia pastoris KMR1500_3/ROL | 甲醇利用通路 | ROL（23-24拷贝） | Rhizopus oryzae脂肪酶 | 催化 | Muts多拷贝ROL菌株，经HIS4回复为组氨酸原养型 |
| Pichia pastoris | 甲醇利用通路 | P_AOX1启动子 | — | 调控 | 强甲醇诱导型启动子，用于驱动ROL表达 |
关键发现
- Muts单拷贝菌株的比生产率和YP/X分别比Mut+单拷贝菌株高1.29倍和2.34倍
- Mut+单拷贝菌株的体积生产率比Muts单拷贝菌株高1.34倍（3000 vs 2246 UA/l/h）。最大脂肪酶活性：Muts单拷贝205 UA/ml，Muts多拷贝140 UA/ml（组氨酸补充培养），Mut+单拷贝150 UA/ml，Mut+多拷贝175 UA/ml。YP/X（UA/g）：Muts单拷贝5775，Muts多拷贝7500，Mut+单拷贝2470，Mut+多拷贝3578。基因剂量增加在两种表型中都导致体积生产率下降（单拷贝：多拷贝约为1.5-1.6倍）。多拷贝Muts菌株含23-24个ROL基因拷贝，培养中约10小时后细胞代谢活性下降。Muts菌株的比生长速率均低于0.02 h^-1，而Mut+单拷贝菌株最大比生长速率为0.051 h^-1，多拷贝为0.028 h^-1。
研究结论
Muts菌株在比生产率和YP/X上优于Mut+，但Mut+菌株因培养时间短而体积生产率更高；Muts菌株因其残余甲醇浓度易于控制而具有过程控制优势。基因剂量增加在两种表型下均对细胞生理造成负担，导致生产率和生长速率下降，Muts多拷贝菌株在生物反应器中无法持续生产。