High level expression of a hydrophobic poly(ethylene terephthalate)-hydrolyzing carboxylesterase from Thermobifida fusca KW3 in Escherichia coli BL21(DE3)
- 作者
- Thorsten Oeser, Ren Wei, Thomas Baumgarten, Susan Billig, Christina Follner, Wolfgang Zimmermann
- 单位
- Department of Microbiology and Bioprocess Technology, University of Leipzig, Johannisallee 21-23, D-4103 Leipzig, Germany
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2010）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2010.02.006
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
在E. coli BL21(DE3)中高效表达来自Thermobifida fusca KW3的高度疏水PET水解羧酸酯酶TfCa，克服密码子偏好差异、包涵体形成和疏水蛋白毒性等表达障碍。
研究策略
将tfca基因进行大肠杆菌密码子优化，构建含pelB信号肽和His6标签的pET-20b(+)融合表达载体；优化诱导条件，降低培养温度至18°C以减少包涵体形成，并使用pH控制生物反应器进行高密度培养。
核心内容
该研究针对来自 Thermobifida fusca KW3 的高度疏水 PET 水解羧酸酯酶 TfCa 在大肠杆菌 BL21(DE3) 中表达困难的问题，通过密码子优化、融合信号肽及低温培养等策略实现了高效表达。研究者将 tfca 基因按大肠杆菌密码子偏好进行优化，使密码子适应指数从 0.71 提升至 0.98，GC 含量从 69% 降至 52%，并构建含 pelB 信号肽和 His6 标签的 pET-20b(+) 融合表达载体。通过将培养温度降至 18°C 并维持 16 小时，显著减少了包涵体形成，活性较 37°C 培养提高近 4 倍。在 pH 控制的生物反应器中进行高密度培养，TfCa 蛋白浓度达到 41.6 mg/L，对应酶活性 3000 U/L，总活性较野生菌株提高约 4500 倍，比活性提高 30 倍以上。纯化后的 TfCa 在 0.01 mg/mL 浓度下于 50°C 孵育 24 小时，释放出 7 mol/mL 的 PET 水解产物对苯二甲酸，验证了其催化功能。该研究为疏水 PET 水解酶的大规模工业生产和应用提供了可行的高效表达方案。
创新点
['对来自T. fusca KW3的tfca基因进行密码子优化，使密码子适应指数(CAI)从0.71提升至0.98，GC含量从69%降至52%。', '采用低温培养（18°C）显著降低包涵体形成，提高活性蛋白产量。', '通过优化表达条件，实现了TfCa活性较野生菌株提高约4500倍。']
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | — | tfca | TfCa | 催化 | 重组表达宿主，表达密码子优化的tfca基因，融合pelB信号肽和His6标签 |
| Thermobifida fusca KW3 | — | tfca | TfCa | 催化 | 原始产酶菌株，分泌疏水性PET水解羧酸酯酶 |
| Escherichia coli | — | pelB | pelB信号肽 | 转运 | 引导重组蛋白转运至周质空间 |
关键发现
- 密码子优化后，胞内酯酶活性提高5倍，培养基中活性提高约3倍
- 降低培养温度至18°C并培养16 h，活性比37°C培养提高近4倍
- 优化条件下TfCa活性（U/mL）比野生T. fusca KW3高约4500倍，比活性（U/mg）提高30倍以上
- 在pH控制的生物反应器中，TfCa蛋白浓度达到41.6 mg/L，对应酶活性3000 U/L
- 纯化后的TfCa在0.01 mg/mL浓度下，于50°C孵育24 h，释放出7 mol/mL的PET水解产物对苯二甲酸。
研究结论
通过密码子优化和降低培养温度等策略，成功在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了高度疏水的TfCa羧酸酯酶的高水平表达，为PET水解酶在工业应用中的大规模生产提供了有效方法。