Asymmetric bioreduction of activated alkenes to industrially relevant optically active compounds

作者: Christoph K. Winkler, Gábor Tasnádi, Dorina Clay, Mélanie Hall, Kurt Faber
单位: ACIB Co. c/o, Heinrichstrasse 28, 8010 Graz, Austria; Department of Chemistry, Organic & Bioorganic Chemistry, University of Graz, Heinrichstrasse 28, 8010 Graz, Austria
杂志: Journal of Biotechnology（2012）
DOI: 10.1016/j.jbiotec.2012.03.023
所属领域: 生物催化与合成生物学
关键词: Asymmetric reductionBiocatalysisChiral building blocksEne-reductaseOld Yellow Enzyme
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解决的核心问题

利用烯还原酶（Old Yellow Enzyme家族）高效、高立体选择性地还原活化烯烃，制备工业相关的手性光学活性化合物，同时解决辅因子成本高和立体选择性控制等难题。

研究策略

系统综述烯还原酶的催化机制、底物谱、酶资源、辅因子再生策略，并通过应用实例（氨基酸衍生物、萜类、香料、手性砌块等）总结底物工程与酶选择对立体选择性的调控规律。

研究路线图

100%

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核心内容

该文系统综述了烯还原酶（OYE家族）在不对称还原活化烯烃制备手性化合物方面的应用进展。研究梳理了来自酿酒酵母、枯草芽孢杆菌等多种微生物的烯还原酶资源及其催化机制，重点总结了底物谱与立体选择性的调控规律。通过底物工程策略，改变底物保护基大小或N-酰基保护基可实现立体选择性翻转，如α-烷氧基烯酮两种对映体均可获得大于99%的ee值。辅因子再生方面，介绍了偶联底物单酶脱歧化及多酶级联等经济方案，以应对NADH约500欧元/克、NADPH约1400欧元/克的高昂成本。典型应用包括：YqjM还原天冬氨酸酯衍生物达定量转化和99% ee；OYE1-3在双相体系中还原α-甲基肉桂醛衍生物合成香料Lilial和Helional，产率定量且ee大于95%；OYE1与醇脱氢酶级联合成γ-丁内酯，产率最高80%、ee大于99%。结果表明烯还原酶结合辅因子循环和蛋白工程，可高效经济地合成多种工业相关手性砌块，为工业化应用提供了可行路线。

创新点

总结了立体互补的烯还原酶同源酶和底物工程策略，通过改变底物保护基大小或N-酰基保护基团实现立体选择性翻转；介绍了新型辅因子再生系统（如偶联底物单酶脱歧化）和多酶级联反应。

研究对象（31）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Saccharomyces pastorianus	α,β-不饱和化合物不对称还原	OYE1	OYE1	催化	Old Yellow Enzyme 1，还原β-硝基丙烯酸酯等底物，ee≥87%
Saccharomyces cerevisiae	α,β-不饱和化合物不对称还原	OYE2	OYE2	催化	还原4-酮异佛尔酮生成(R)-levodione，用于级联合成(4R,6R)-actinol
Saccharomyces cerevisiae	α,β-不饱和化合物不对称还原	OYE3	OYE3	催化	还原脱氢氨基酸衍生物，立体偏好可通过N-酰基保护基大小切换；还原α-卤代酯得(S)-产物ee≥88%
Bacillus subtilis	α,β-不饱和化合物不对称还原	YqjM	YqjM	催化	还原脱氢氨基酸衍生物，产物ee达97-99%
Zymomonas mobilis	α,β-不饱和化合物不对称还原	NCR	NCR	催化	NAD(P)H依赖的2-环己烯-1-酮还原酶，亦能还原Roche酯前体
Pseudomonas putida II-B	α,β-不饱和化合物不对称还原	xenA	XenA	催化	异生物质还原酶A，用于4-酮异佛尔酮和α-烷氧基烯酮还原
Pseudomonas fluorescens I-C	α,β-不饱和化合物不对称还原	xenB	XenB	催化	异生物质还原酶B，用于手性酰基化合物合成
Enterobacter cloacae PB2	α,β-不饱和化合物不对称还原	PETNr	PETNr	催化	季戊四醇四硝酸酯还原酶，还原香芹酮得de 95%和88%
Thermoanaerobacter pseudoethanolicus E39	α,β-不饱和化合物不对称还原	TOYE	TOYE	催化	嗜热烯还原酶，用于4-酮异佛尔酮还原
Thermus scotoductus SA-01	α,β-不饱和化合物不对称还原	CrS	CrS	催化	铬酸盐还原酶，与Old Yellow Enzyme相关，用于4-酮异佛尔酮还原
Pseudomonas putida M10	吗啡代谢相关	MR	MR	催化	吗啡酮还原酶，用于4-酮异佛尔酮还原
Arabidopsis thaliana	茉莉酸生物合成	OPR1	OPR1	催化	12-氧代植物二烯酸还原酶1，用于4-酮异佛尔酮和Roche酯前体还原
Solanum lycopersicum	茉莉酸生物合成	OPR3	OPR3	催化	番茄12-氧代植物二烯酸还原酶3，用于4-酮异佛尔酮还原
Agrobacterium radiobacter	α,β-不饱和化合物不对称还原	nerA	NerA	催化	甘油三硝酸酯还原酶，用于手性酰基化合物和Roche酯前体还原
Escherichia coli	α,β-不饱和化合物不对称还原	nemA	NemR	催化	N-乙基马来酰亚胺还原酶，用于4-酮异佛尔酮还原
Kluyveromyces lactis	α,β-不饱和化合物不对称还原	KYE1	KYE1	催化	乳克鲁维酵母黄酶1，用于4-酮异佛尔酮还原
Gluconobacter oxydans DSM 2343	α,β-不饱和化合物不对称还原	—	Gluconobacter oxydans ene-reductase	催化	用于4-酮异佛尔酮还原
Corynebacterium aquaticum M-13	酮还原	—	Levodione reductase	催化	与OYE2级联将(R)-levodione还原为(4R,6R)-actinol，配合GDH再生NADH
Thermoanaerobacter sp.	酮还原	—	ADH-T	催化	Prelog型醇脱氢酶，用于γ-丁内酯级联中的羰基还原
Lactobacillus kefir	酮还原	—	ADH-LK	催化	anti-Prelog型醇脱氢酶，用于γ-丁内酯级联中的羰基还原
—	辅因子再生	—	Glucose dehydrogenase	催化	用于NADH再生，氧化葡萄糖生成葡萄糖酸内酯
—	辅因子再生	—	Formate dehydrogenase	催化	氧化甲酸生成CO2，再生NADH，但可能带有ADH杂质
—	辅因子再生	—	ADH-A	催化	以2-丙醇为氢供体再生NADH，产生丙酮
—	辅因子再生	—	Glucose-6-phosphate dehydrogenase	催化	只接受NADP+，用于NADPH再生
—	辅因子再生	—	Phosphite dehydrogenase	催化	氧化亚磷酸盐生成磷酸，提供pH控制，用于α,β-不饱和腈还原
Candida macedoniensis AKU4588	α,β-不饱和化合物不对称还原	—	Old yellow enzyme	催化	催化酮异佛尔酮C=C键立体特异性还原
Candida albicans	α,β-不饱和化合物不对称还原	EBP1	EBP1	催化	雌激素结合蛋白，用于4-酮异佛尔酮还原
Pichia stipitis CBS 6054	α,β-不饱和化合物不对称还原	OYE2.6	OYE2.6	催化	用于4-酮异佛尔酮还原
Shewanella oneidensis	α,β-不饱和化合物不对称还原	SYE1-4	SYE1-4	催化	四个Old Yellow Enzyme同源酶，可用于4-酮异佛尔酮还原
Geobacillus kaustophilus DSM 7263	α,β-不饱和化合物不对称还原	GKOYE	GKOYE	催化	嗜热烯还原酶，用于4-酮异佛尔酮还原
Yersinia bercovieri	α,β-不饱和化合物不对称还原	YersER	YersER	催化	用于4-酮异佛尔酮还原

关键发现

['β-硝基丙烯酸酯经OYE1还原，ee≥87%，相应β2-氨基酸盐酸盐总产率为57-73%。', 'YqjM还原N-酰基丙氨酸衍生物5a得(S)-5b，转化率41%、ee 97%
还原天冬氨酸酯8a达定量转化和99% ee。', 'OYE3还原6a、7a、10a得(S)-氨基酸衍生物（ee 23%至>99%），而8a、9a、11a得(R)-对映体（ee 61%至92%）。', 'PETN还原酶还原(5R)-和(5S)-香芹酮得(2R)-二氢香芹酮，de分别为95%和88%。', '多种OYE还原(E/Z)-柠檬醛得(S)-香茅醛（定量，ee>95%）和(R)-香茅醛（69%转化率，ee>95%）。', 'OYE1-3在含20%叔丁基甲醚双相体系中还原α-甲基肉桂醛衍生物，定量产率、ee>95%，合成Lilial和Helional。', '4-酮异佛尔酮被所有OYE家族还原为(R)-levodione（ee>99%）
与levodione还原酶级联及GDH再生NADH，得(4R,6R)-actinol，定量转化、94% ee。', '通过底物工程改变O-保护基大小，α-烷氧基烯酮两种对映体可达>99% ee。', 'OYE1与ADH级联合成γ-丁内酯：Prelog型ADH-T得(2R,4S)-22c，anti-Prelog型ADH-LK得(2R,4R)-22c，产率最高80%、ee>99%。', '甲基2-羟甲基丙烯酸酯衍生物经烯还原酶还原得(R)-Roche酯，几乎全部>99% ee
底物保护基修饰可显著提高反应速率至>99%转化率。', 'OYE3还原α-卤代-β-取代丙烯酸甲酯得(S)-产物，ee≥88%
芳环给电子基使转化率最高20%，吸电子基使转化率58-91%，无取代基为37-38%。', 'α-溴代-α,β-不饱和酯的(E/Z)-异构体均被还原为(S)-产物，ee最高97%。', '商业烯还原酶还原α,β-不饱和腈，产率高、ee最高99%。', '辅因子NADH约500€/g、NADPH约1400€/g，需要原位再生
ATP再生系统的TTN仍限于10^3-10^4。']

研究结论

烯还原酶具有优异的化学、区域和立体选择性，结合辅因子循环可实现经济高效的手性分子合成；立体互补酶和底物工程可分别获得两种对映体，蛋白工程进一步拓展其应用潜力。