Structure-guided engineering of Lactococcus lactis alcohol dehydrogenase LlAdhA for improved conversion of isobutyraldehyde to isobutanol
- 作者
- Xiang Liu, Sabine Bastian, Christopher D. Snow, Eric M. Brustad, Tatyana E. Saleski, Jian-He Xu, Peter Meinhold, Frances H. Arnold
- 单位
- Division of Chemistry and Chemical Engineering, California Institute of Technology; State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology; Gevo, Inc.
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2012）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2012.08.008
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
提高乳酸乳球菌乙醇脱氢酶LlAdhA对非天然底物异丁醛的还原活性，以改善异丁醇生物合成途径中最后一步的效率。
研究策略
解析野生型LlAdhA及其进化变体LlAdhA^RE1的晶体结构，基于结构信息进行结构引导的饱和突变，并结合定向进化进一步优化酶活性。
核心内容
该研究通过结构引导的酶工程策略，对乳酸乳球菌乙醇脱氢酶LlAdhA进行改造，以提高其催化非天然底物异丁醛还原为异丁醇的效率。作者首先解析了野生型LlAdhA及其定向进化变体LlAdhA^RE1的高分辨率晶体结构，通过结构比较揭示了活性提升的分子基础，并据此设计饱和突变，最终结合定向进化获得四重突变体LlAdhA^29C8（Y50F/N110S/I212T/L264V）。该变体对异丁醛的K_M由野生型的12 mM降至0.68 mM，降低约17倍，催化效率（kcat/K_M）从2.8 mM⁻¹s⁻¹提升至440 mM⁻¹s⁻¹，提高约160倍；对副产物5-HMF的K_M也降低约38倍。研究还发现LlAdhA^RE1（Y50F/I212T/L264V）对异丁醛的K_M降低约7倍，催化效率提高约30倍。该工作表明结构信息指导的饱和突变能有效优化醇脱氢酶对非天然底物的适应性，所得的LlAdhA^29C8为异丁醇等生物燃料的微生物合成提供了高效催化剂。
创新点
首次解析了乳酸乳球菌乙醇脱氢酶的高分辨率晶体结构；通过结构比较揭示了进化变体活性提高的结构基础；利用结构引导的饱和突变获得催化效率大幅提升的四重突变体。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异丁醇生物合成（异丁醛→异丁醇） | LlAdhA | 野生型LlAdhA | 催化 | 用于蛋白表达、纯化及晶体学分析 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2 | 异丁醇生物合成（异丁醛→异丁醇） | LlAdhA变体（RE1、29C8等） | LlAdhA^RE1、LlAdhA^29C8等 | 催化 | 用于突变体文库构建和高通量筛选 |
| Lactococcus lactis | 天然乙醇发酵途径 | adhA | LlAdhA（野生型） | 催化 | 来源菌株，该酶为NADH依赖性醇脱氢酶 |
关键发现
LlAdhA^RE1（含Y50F、I212T、L264V突变）相比野生型，对异丁醛的K_M降低约7倍，催化效率(kcat/KM)提高约30倍。在结构引导的饱和突变基础上获得四重突变体LlAdhA^29C8（Y50F/N110S/I212T/L264V），其对异丁醛的K_M较野生型降低约17倍（从12 mM降至0.68 mM），催化效率提高约160倍（从2.8 mM^-1 s^-1升至440 mM^-1 s^-1）。LlAdhA^29C8对5-HMF的K_M也降低约38倍（从22 mM降至0.57 mM）。
研究结论
结构引导的饱和突变和定向进化能够有效优化醇脱氢酶对非天然底物的活性，获得的LlAdhA^29C8具有显著提高的异丁醛还原活性和催化效率，为异丁醇等下一代生物燃料的生产提供了更优的酶催化剂。