Production of the sesquiterpene (+)-valencene by metabolically engineered Corynebacterium glutamicum
- 作者
- Jonas Frohwitter, Sabine A.E. Heider, Petra Peters-Wendisch, Jules Beekwilder, Volker F. Wendisch
- 单位
- Chair of Genetics of Prokaryotes, Faculty of Biology & CeBiTec, Bielefeld University; Plant Research International, Wageningen
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2014）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2014.05.032
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
谷氨酸棒杆菌自然合成类胡萝卜素，但能否通过代谢工程使其生产倍半萜(+)-缬兰烯尚属空白；同时(+)-缬兰烯对菌株具有毒性，且其前体法尼基焦磷酸供给不足。
研究策略
在谷氨酸棒杆菌中异源表达缬兰烯合酶；敲除内源香叶基香叶基焦磷酸合酶基因crtE和idsA，并异源表达大肠杆菌ispA或酿酒酵母ERG20提供FPP；采用正十二烷两相培养原位萃取(+)-缬兰烯以减轻产物毒性。
核心内容
该研究首次在谷氨酸棒杆菌中实现了倍半萜(+)-缬兰烯的异源生产。研究人员在野生型菌株中异源表达甜橙缬兰烯合酶CsTPS1未能检测到产物，因此进一步敲除内源香叶基香叶基焦磷酸合酶基因crtE和idsA，转而异源表达大肠杆菌ispA或酿酒酵母ERG20以供给法尼基焦磷酸前体，使产量达到0.22 mg/L。随后将缬兰烯合酶替换为努特卡扁柏来源的CnVS，并结合正十二烷两相培养原位萃取以缓解产物毒性，产量提升约10倍至2.41 mg/L，同时积累少量副产物。实验证实4 mM(+)-缬兰烯可使菌株生长速率降低约40%，而正十二烷覆盖层对生长基本无影响，分配系数log Kd为2.29。基因表达分析显示产物胁迫下外排泵基因mmpL2上调100倍。该研究为谷氨酸棒杆菌生产其他倍半萜类化合物提供了可行的代谢工程策略。
创新点
['首次在谷氨酸棒杆菌中实现倍半萜(+)-缬兰烯的异源生产', '通过敲除内源GGPP合酶并异源表达FPP合酶解决了FPP前体供给不足的问题', '证实正十二烷覆盖层与谷氨酸棒杆菌生长兼容，并可高效萃取(+)-缬兰烯', '对比了甜橙与努特卡扁柏来源的缬兰烯合酶，后者产量提升约10倍']
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Corynebacterium glutamicum WT (ATCC13032) | 类异戊二烯/MEP途径 | crtE | CrtE | 催化 | 内源香叶基香叶基焦磷酸合酶，被敲除以减少FPP向GGPP的消耗 |
| Corynebacterium glutamicum WT (ATCC13032) | 类异戊二烯/MEP途径 | idsA | IdsA | 催化 | 内源香叶基香叶基焦磷酸合酶，与crtE共同敲除 |
| Corynebacterium glutamicum ΔcrtEΔidsA | 倍半萜生物合成 | ispA | IspA | 催化 | 来自大肠杆菌的FPP合酶，异源表达提供FPP前体 |
| Corynebacterium glutamicum ΔcrtEΔidsA | 倍半萜生物合成 | ERG20 | Erg20 | 催化 | 来自酿酒酵母的FPP合酶，异源表达提供FPP前体 |
| Corynebacterium glutamicum ΔcrtEΔidsA | 倍半萜生物合成 | CsTPS1 | CsTPS1 | 催化 | 来自甜橙的(+)-缬兰烯合酶，密码子优化后异源表达 |
| Corynebacterium glutamicum ΔcrtEΔidsA | 倍半萜生物合成 | CnVS | CnVS | 催化 | 来自努特卡扁柏的(+)-缬兰烯合酶，未进行密码子优化，产量更高 |
| Corynebacterium glutamicum ΔcrtB2ΔcrtI2-1/2ΔcrtB | 类胡萝卜素生物合成 | crtB/crtB2 | CrtB/CrtB2 | 催化 | 内源植物烯合酶，被敲除以阻断类胡萝卜素合成，尝试用于FPP积累但未成功 |
| Corynebacterium glutamicum WT (ATCC13032) | 胁迫响应 | mmpL2 | MmpL2 | 转运 | 推测的多药外排蛋白，在(+)-缬兰烯胁迫下上调100倍，可能参与外排 |
| Corynebacterium glutamicum WT (ATCC13032) | 胁迫响应 | cg1053 | Cg1053 | 调控 | TetR家族转录调控因子，在(+)-缬兰烯胁迫下上调约30倍，可能调控mmpL2表达 |
关键发现
['仅异源表达甜橙缬兰烯合酶CsTPS1不能使谷氨酸棒杆菌产(+)-缬兰烯（<0.02 mg/L）', '在ΔcrtEΔidsA菌株中异源表达酿酒酵母ERG20和甜橙合酶（VLC1）产量为0.15±0.01 mg/L（20±1 μg/g CDW）', '在ΔcrtEΔidsA菌株中异源表达大肠杆菌ispA和甜橙合酶（VLC2）产量为0.22±0.04 mg/L（31±6 μg/g CDW）', '使用努特卡扁柏缬兰烯合酶CnVS替换CsTPS1（VLC3）产量提高至2.41±0.26 mg/L（251±26 μg/g CDW），约10倍提升', 'VLC3还积累β-elemene约0.98 mg/L和germacrene A约0.25 mg/L（以缬兰烯为参考估算）', '4 mM (+)-缬兰烯使谷氨酸棒杆菌生长速率从0.22±0.01 h⁻¹降至0.14±0.01 h⁻¹（降低约40%）', '正十二烷覆盖层（1/10或等体积）对谷氨酸棒杆菌生长基本无影响，生长速率分别为0.21±0.01和0.20±0.01 h⁻¹', '(+)-缬兰烯在正十二烷/培养基中的分配系数log Kd=2.29±0.25', '基因表达分析显示(+)-缬兰烯胁迫下多药外排泵mmpL2基因上调100倍，其邻近调控基因cg1053上调约30倍']
研究结论
通过组合敲除内源GGPP合酶基因、异源表达FPP合酶（IspA或ERG20）以及高效的缬兰烯合酶CnVS，并在正十二烷两相体系中进行原位萃取，首次实现了谷氨酸棒杆菌对倍半萜(+)-缬兰烯的生产，最高产量达2.41 mg/L。