Enhanced isoprene biosynthesis in Saccharomyces cerevisiae by engineering of the native acetyl-CoA and mevalonic acid pathways with a push-pull-restrain strategy
- 作者
- Xiaomei Lv, Wenping Xie, Wenqiang Lu, Fei Guo, Jiali Gu, Hongwei Yu, Lidan Ye
- 单位
- Key Laboratory of Biomass Chemical Engineering of Ministry of Education, Department of Chemical and Biological Engineering, Zhejiang University, Hangzhou 310027, PR China
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2014）
- DOI
- 10.1016/j.jbiotec.2014.06.024
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过系统代谢工程改造酿酒酵母，提高异戊二烯这一重要合成橡胶单体的生物合成产量，以替代高能耗、高成本的石油基生产路线。
研究策略
提出并实施'推-拉-抑制'（push-pull-restrain）策略：通过过量表达tHMG1增强乙酰-CoA模块和MVA途径的前体供应（push）；通过过量表达IDI1和异戊二烯合酶ispS增强异戊二烯分支通量（pull）；通过用弱启动子P_HXT1或P_BTS1替换ERG20天然启动子以削弱竞争性的FPP分支（restrain）。同时敲除GAL80以解除对Gal启动子的抑制，并优化碳源（蔗糖-甘油组合）降低生产成本。
核心内容
本研究在酿酒酵母中通过“推-拉-抑制”策略系统改造天然乙酰-CoA与甲羟戊酸途径，以提高异戊二烯产量。研究者通过过表达tHMG1强化前体供应，过表达IDI1和异戊二烯合酶ispS增强目标分支通量，并用弱启动子替换ERG20启动子削弱竞争性的FPP分支。同时敲除GAL80以解除半乳糖诱导依赖，并优化碳源组合。结果显示，仅过表达tHMG1使产量提升91%但角鲨烯积累增加8.4倍，表明竞争通量是主要瓶颈；弱化ERG20后角鲨烯降至1/14-1/17，异戊二烯产量最高提升49倍。进一步共表达乙醛/乙酸代谢基因与ACS2/ERG10后，最终工程菌株YXM10-ispS-ispS在好氧条件下以蔗糖-甘油为碳源时产量达37 mg/L，较亲本菌株的47 μg/L提高约782倍。该策略证明ERG20下调是MVA途径调控的关键，乙酸盐利用为乙酰-CoA代谢限速步骤，且GAL80敲除实现了低成本碳源生产，为酿酒酵母作为异戊二烯生物合成平台奠定了基础。
创新点
['首次在酿酒酵母中采用push-pull-restrain策略系统调控天然乙酰-CoA和甲羟戊酸途径用于异戊二烯生产', '敲除GAL80实现无需半乳糖诱导即可维持Gal启动子高表达，降低原料成本', '鉴定出乙酸盐利用是乙酰-CoA代谢途径的主要限速步骤', '通过弱化ERG20启动子有效抑制竞争通量，显著提高异戊二烯产量']
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 甲羟戊酸（MVA）途径 | tHMG1 | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（截短型） | 催化 | 过量表达增强MVA途径前体供应（push策略） |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 甲羟戊酸（MVA）途径 | IDI1 | 异戊烯基焦磷酸异构酶 | 催化 | 过量表达以促进IPP向DMAPP转化（pull策略） |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 异戊二烯合成分支 | ispS | 异戊二烯合酶（源自银白杨Populus alba） | 催化 | 双拷贝过量表达以增强异戊二烯分支通量（pull策略） |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 类异戊二烯竞争途径（甾醇/法呢基焦磷酸） | ERG20 | 法呢基焦磷酸合酶 | 催化 | 用弱启动子P_HXT1或P_BTS1替换其天然启动子，削弱竞争通量（restrain策略） |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 乙醛/乙酸代谢 | ADH2 | 乙醇脱氢酶2 | 催化 | 与ALD6共表达，促进乙醛生成以增加乙酸前体供应 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 乙醛/乙酸代谢 | ALD6 | 乙醛脱氢酶 | 催化 | 过量表达以将乙醛转化为乙酸，增强乙酰-CoA前体供应 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 乙酰-CoA合成 | ACS2 | 乙酰辅酶A合成酶 | 催化 | 与ERG10共表达，增强乙酸向乙酰-CoA的转化，解除乙酸利用限速步骤 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 甲羟戊酸（MVA）途径上游 | ERG10 | 乙酰乙酰辅酶A硫解酶 | 催化 | 与ACS2共表达，增强乙酰-CoA向MVA途径的流入 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4741 | 半乳糖调控网络 | GAL80 | Gal80p转录抑制因子 | 调控 | 敲除GAL80使Gal启动子在无半乳糖条件下仍可高表达，降低生产成本 |
关键发现
- ['最终工程菌株YXM10-ispS-ispS在好氧条件下、以0.6%蔗糖+1.4%甘油为碳源时，异戊二烯产量达到37 mg/L，比亲本菌株BY4741-ispS（47 μg/L）提高约782倍', '过表达tHMG1后，异戊二烯产量从47 μg/L提高到90 μg/L（提升91%），但角鲨烯产量提高8.4倍（23.5 mg/L vs 2.5 mg/L）', '双拷贝过表达ispS使异戊二烯产量达到0.2 mg/L，较单拷贝对照0.09 mg/L提高122%
- 而过表达IDI1无明显改善', '用弱启动子P_HXT1和P_BTS1替换ERG20启动子后，角鲨烯产量降至原来的1/14-1/17，异戊二烯产量分别达到4.0 mg/L和9.8 mg/L（较0.2 mg/L提升20倍和49倍）', '共表达ALD6和ADH2使乙酸产量提高2.4倍，但异戊二烯产量和生物量下降
- 进一步共表达ACS2和ERG10后，YXM08-ispS-ispS产量达6.65 mg/L（较YXM03提升60%），YXM09-ispS-ispS产量达11.14 mg/L', '敲除GAL80后，YXM10-ispS-ispS在蔗糖-甘油混合碳源中的产量与YXM09在SG-URA（半乳糖）中相当
- 好氧批次发酵产量（37 mg/L）约为微好氧条件下的3-4倍']
研究结论
通过push-pull-restrain策略工程改造酿酒酵母天然乙酰-CoA和甲羟戊酸途径，可将异戊二烯产量从0.047 mg/L提升至37 mg/L（提高782倍），证明酿酒酵母可作为异戊二烯生物合成的潜在平台。其中ERG20下调对MVA途径调控至关重要，乙酸盐利用是乙酰-CoA代谢的限速步骤，GAL80敲除实现了低成本碳源生产。