Spatial organization of the vindoline biosynthetic pathway in Catharanthus roseus
- 作者
- Grégory Guirimand, Anthony Guihur, Pierre Poutrain, François Héricourt, Samira Mahroug, Benoit St- Pierre, Vincent Burlat, Vincent Couravault
- 单位
- Université François Rabelais de Tours, EA 2106 "Biomolécules et Biotechnologies Végétales", IFR 135 "Imagerie fonctionnelle" 37200 Tours, France; Université d'Orléans, EA1207 Laboratoire de Biologie des Ligneux et Grandes Cultures, and INRA, USC2030, Arbres et Réponses aux Contraintes Hydrique et Environnementales (ARCHE), 45067 Orléans, France; Laboratoire Biodiversité Végétale, Conservation et Valorisation - Faculté des Sciences - Université Djillali Liabés - Sidi Bel Abbes 22000, Algerie
- 杂志
- Journal of Plant Physiology（2010）
- DOI
- 10.1016/j.jplph.2010.08.018
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析长春花（Catharanthus roseus）中vindoline生物合成途径的空间组织，明确tabersonine转化为vindoline六步反应中已表征酶（T16H、16OMT、D4H、DAT）在细胞及亚细胞水平的定位与相互作用，并探讨中间产物跨区室转运的调控意义。
研究策略
采用RNA原位杂交明确16OMT的细胞定位；结合GFP/YFP荧光成像、双分子荧光互补（BiFC）和酵母双杂交分析，研究T16H、16OMT、D4H、DAT的亚细胞定位与蛋白互作；通过PCR克隆T16H 5'端，并构建跨膜螺旋全长、单独跨膜螺旋及缺失跨膜螺旋的融合蛋白，验证ER锚定机制。
核心内容
该研究系统解析了长春花vindoline生物合成途径中四个已表征酶的空间组织与相互作用。通过RNA原位杂交发现16OMT转录本特异定位于子叶和幼叶的上下表皮，成熟叶中无信号。利用GFP/YFP荧光成像和BiFC、酵母双杂交分析表明，T16H通过N端18残基跨膜螺旋（Y4-T21）锚定于内质网，缺失该螺旋后丧失ER定位；16OMT在细胞质中形成同源二聚体（约79.6 kDa），超过核孔被动扩散极限60 kDa而被排除在核外，单体形式则呈核质分布；D4H和DAT均为小于50 kDa的可溶性单体，以被动扩散分布于核与细胞质。四种酶之间未检测到任何直接相互作用，提示该途径不存在代谢通道。研究揭示了vindoline合成至少涉及表皮和乳管/异细胞两种细胞类型以及内质网、细胞质、质体、细胞核四个亚细胞区室，中间产物的跨细胞和跨区室转运可能是萜类吲哚生物碱生物合成的重要调控机制。
创新点
首次通过原位杂交证明16OMT转录本特异定位于长春花地上器官（子叶和幼叶）的上、下表皮；克隆了T16H cDNA 5'端，鉴定出N端18残基跨膜螺旋（Y4-T21）决定其ER锚定；发现16OMT以同源二聚体形式存在于细胞质，二聚体尺寸超过核孔被动扩散极限而被排除在细胞核外；证明D4H和DAT均为可溶性单体，定位于核质，且四种酶之间无相互作用，提示vindoline生物合成无代谢通道。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus（长春花）悬浮细胞及幼苗叶片/子叶组织 | vindoline生物合成途径（萜类吲哚生物碱TIA） | T16H (CYP71D12) | tabersonine 16-hydroxylase | 催化 | 细胞色素P450单加氧酶，催化tabersonine C16羟基化；通过N端跨膜螺旋锚定于内质网，以单体形式存在 |
| Catharanthus roseus（长春花）悬浮细胞及幼苗叶片/子叶组织 | vindoline生物合成途径（萜类吲哚生物碱TIA） | 16OMT | 16-hydroxytabersonine 16-O-methyltransferase | 催化 | 催化16-羟基他波宁的O-甲基化；在细胞质中形成同源二聚体，被排除在细胞核外，定位于表皮 |
| Catharanthus roseus（长春花）悬浮细胞及幼苗叶片/子叶组织 | vindoline生物合成途径（萜类吲哚生物碱TIA） | D4H | desacetoxyvindoline-4-hydroxylase | 催化 | 2-酮戊二酸依赖性双加氧酶，催化desacetoxyvindoline C4羟基化；以单体形式定位于核质，无相互作用 |
| Catharanthus roseus（长春花）悬浮细胞及幼苗叶片/子叶组织 | vindoline生物合成途径（萜类吲哚生物碱TIA） | DAT | deacetylvindoline-4-O-acetyltransferase | 催化 | 乙酰辅酶A依赖性酰基转移酶，催化脱乙酰长春多灵C4位O-乙酰化；以单体形式定位于核质，无相互作用 |
关键发现
- 16OMT转录本在子叶和幼叶的上下表皮特异表达，成熟叶中无信号
- T16H通过N端18残基跨膜螺旋（Y4-T21）锚定于内质网，缺失该螺旋（ΔthT16H，T22-A506）后丧失ER定位
- 16OMT在细胞质中形成同源二聚体（无YFP时79.6 kDa，含YFP时106.6 kDa），大于核孔被动扩散极限60 kDa，故被排除在核外，而单体16OMT-YFP融合蛋白呈核质分布
- D4H和DAT均为小于50 kDa的单体（融合YFP后约75 kDa），以被动扩散分布于细胞核和细胞质，未检测到D4H/DAT同源或异源二聚化
- BiFC和酵母双杂交均未检测到T16H与16OMT的相互作用，表明vindoline途径前两步无代谢通道。
研究结论
长春花中vindoline生物合成从tabersonine开始至少涉及两种细胞类型（表皮细胞和乳管/异细胞）以及四个亚细胞区室（内质网、细胞质、质体、细胞核）。T16H锚定于ER，16OMT在细胞质中形成同源二聚体，D4H和DAT以可溶性单体存在于核质，各酶之间无代谢通道；中间产物在细胞间和细胞内的转运可能是TIA生物合成的调控机制之一。