Cloning and expression of 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase cDNA from Croton stellatopilosus and expression of 2C-methyl-D-erythritol 4-phosphate synthase and geranylgeranyl diphosphate synthase, key enzymes of plaunotol biosynthesis
- 作者
- Worapan Sitthithaworn, Juraithip Wungsintaweekul, Tanawan Sirisuntipong, Tossaton Charoonratana, Yutaka Ebizuka, Wanchai De-Eknamkul
- 单位
- Department of Pharmaceutical Chemistry and Pharmacology, Faculty of Pharmacy, Srinakharinwirot University; Department of Pharmacology and Pharmaceutical Botany, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Prince of Songkla University; Graduate School of Pharmaceutical Sciences, The University of Tokyo; Department of Pharmacology, Faculty of Pharmaceutical Sciences, Chulalongkorn University
- 杂志
- Journal of Plant Physiology（2009）
- DOI
- 10.1016/j.jplph.2009.09.001
- 所属领域
- 植物代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆巴豆 Croton stellatopilosus 中催化 MEP 途径第一步的 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶（DXS）基因，并分析 dxs、meps、ggpps 三个关键酶基因在叶片发育过程中的表达模式与 plaunotol 生物合成的关系，以阐明叶绿体在 plaunotol 合成中的作用。
研究策略
采用 RACE 技术从幼叶中克隆 csdxs cDNA；通过序列比对、保守基序分析和系统发育树分析预测蛋白功能；利用半定量 RT-PCR 检测不同发育阶段叶片及不同器官中 dxs、meps、ggpps 的转录水平；用 GC 法定量 plaunotol 含量；用透射电镜观察叶绿体和油滴的分布。
研究路线图
核心内容
本研究从巴豆属植物 Croton stellatopilosus 幼叶中克隆了 MEP 途径关键酶 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶基因 csdxs。该基因开放阅读框长 2163 bp，编码 720 个氨基酸，推导蛋白含叶绿体转运肽及硫胺素二磷酸结合位点等保守结构域，预测分子量约 77.6 kDa；序列分析显示 CSDXS 与橡胶树 DXS 一致性最高（89%），与原核来源一致性仅 30%-50%。半定量 RT-PCR 表明 dxs、meps、ggpps 三个基因在未展开幼叶中表达量最高、根中极低，GC 定量显示 plaunotol 含量也在幼叶中显著高于成熟叶和根；透射电镜观察到幼叶栅栏细胞富含叶绿体和油滴。上述结果表明 plaunotol 在叶绿体中经 MEP 途径合成，dxs、meps、ggpps 的表达与产物积累协同变化，是代谢工程改造以提高 plaunotol 产量的关键靶点。
创新点
首次从 C. stellatopilosus 中克隆了 DXS 基因（csdxs），并揭示了 dxs、meps、ggpps 三个基因在幼叶中的协同高表达与 plaunotol 积累密切相关，为后续通过代谢工程提高 plaunotol 产量提供了靶点。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Croton stellatopilosus | MEP 途径（2C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸途径） | csdxs | 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶（DXS） | 催化 | 催化丙酮酸与甘油醛-3-磷酸缩合生成1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸（DXP），为MEP途径第一步限速酶 |
| Croton stellatopilosus | MEP 途径（2C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸途径） | csmeps（meps） | 2C-甲基-D-赤藓醇4-磷酸合酶（MEPS） | 催化 | 催化DXP转化为MEP，该基因此前已克隆，本文分析其表达模式 |
| Croton stellatopilosus | plaunotol 生物合成（二萜合成） | ggpps | 香叶基香叶基二磷酸合酶（GGPPS） | 催化 | 催化1分子DMAPP与3分子IPP缩合生成GGPP，为plaunotol合成提供二萜前体 |
关键发现
- csdxs 的开放阅读框为 2163 bp，编码 720 个氨基酸
- 推导蛋白含叶绿体转运肽、硫胺素二磷酸结合位点（216-246位）和转酮醇酶基序（498-532位），催化残基为 H114、E449、D480、R557
- 预测分子量 77,623 Da，pI 6.80
- CSDXS 与其他植物 DXS 的氨基酸一致性为 68%-89%，与橡胶树 Hevea brasiliensis 同源性最高（89%），与大肠杆菌等原核 DXS 一致性仅 30%-50%
- 半定量 RT-PCR 显示 dxs、meps、ggpps 在未完全展开的幼叶中表达量最高，在根部极低
- 透射电镜显示幼叶栅栏细胞富含叶绿体和油滴，而茎尖很少
- plaunotol 含量在幼叶（第1-3叶）中显著高于成熟叶和根，与基因表达趋势一致。
研究结论
dxs、meps、ggpps 在含叶绿体的组织中表达量高，且与 plaunotol 在幼叶（未完全展开）中的积累呈正相关，表明 plaunotol 在叶绿体中通过 MEP 途径合成，这些基因是调控 plaunotol 生物合成的关键节点，可作为代谢工程改造以提高 plaunotol 产量的候选靶点。