Characterization of the plastidial geraniol synthase from Madagascar periwinkle which initiates the monoterpenoid branch of the alkaloid pathway in internal phloem associated parenchyma
- 作者
- Andrew J. Simkin, Karel Miettinen, Patricia Claudel, Vincent Burlat, Grégory Guirimand, Vincent Courdavault, Nicolas Papon, Sophie Meyer, Stéphanie Godet, Benoit St-Pierre, Nathalie Giglioli-Guivarc'h, Marc J.C. Fischer, Johan Memelink, Marc Clastre
- 单位
- Université François-Rabelais, EA2106, Biomolécules et Biotechnologies Végétales, 31 Avenue Monge, 37200 Tours, France; Institute of Biology, Sylvius Laboratory, Sylviusweg 72, PO Box 9505, 2300 RA Leiden, The Netherlands; Université de Strasbourg, INRA, Métabolisme secondaire de la vigne, Unité mixte de Recherche Santé Vigne et Qualité des vins, 28 rue de Herriisheim, 68021 Colmar, France; Université de Toulouse, UPS, UMR5546, Laboratoire de Recherche en Sciences Végétales, BP 42617, 31326 Castanet-Tolosan, France; CNRS, UMR5546, BP 42617, Castanet-Tolosan, France
- 杂志
- Phytochemistry（2012）
- DOI
- 10.1016/j.phytochem.2012.09.014
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并功能表征长春花(Catharanthus roseus)的香叶醇合成酶(CrGES)，该酶催化香叶基焦磷酸(GPP)生成香叶醇，是单萜吲哚生物碱(MIA)生物合成途径单萜分支的关键步骤，此前尚未在分子水平得到表征。
研究策略
通过3'RACE、PhageWalker和GenomeWalker克隆全长cDNA；在大肠杆菌中异源表达并纯化重组蛋白测定酶活；在酿酒酵母FPS突变体中异源表达验证体内活性；通过瞬时转化荧光蛋白融合构建研究亚细胞定位；利用原位杂交分析组织表达；结合茉莉酸甲酯处理和转录组数据分析表达调控。
核心内容
本研究从长春花中克隆并功能表征了香叶醇合成酶基因CrGES，该酶催化香叶基焦磷酸生成香叶醇，是单萜吲哚生物碱途径单萜分支的起始步骤。通过RACE和GenomeWalker获得全长cDNA，编码589个氨基酸、预测分子量67.7 kDa的蛋白。在大肠杆菌中异源表达重组蛋白，体外酶活测定显示其Km值为58.5 μM；在酵母法尼基焦磷酸合酶突变体中表达CrGES，香叶醇产量达约3.3 mg/L，较空载体提高8.4倍。亚细胞定位实验首次发现该单萜合成酶定位于质体基质及基质丝；原位杂交显示CrGES在内韧皮部相关薄壁细胞中特异表达，且与下游香叶醇10-羟化酶G10H在22个样品中表达高度相关（Pearson相关系数0.977）。茉莉酸甲酯处理4小时后CrGES转录水平显著上升。这些结果证实CrGES是单萜吲哚生物碱途径的关键起始酶，其与G10H在特定细胞中的共表达及产物经基质丝向内质网传递的机制，揭示了该途径的多细胞区室化组织方式。
创新点
首次从长春花中克隆并功能表征了香叶醇合成酶CrGES；证明其定位于质体基质和基质丝(stromules)，这是首次发现单萜合成酶存在于基质丝；揭示了CrGES与G10H在IPAP细胞中共表达以及受茉莉酸甲酯诱导，支持其为MIA途径单萜分支的起始酶。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | MIA生物合成（体外酶活性） | CrGES | 香叶醇合成酶 (Geraniol synthase) | 催化 | 重组蛋白在大肠杆菌中表达并纯化，催化GPP转化为geraniol，Km=58.5 μM |
| Saccharomyces cerevisiae | 单萜生物合成 | CrGES (truncated) | 香叶醇合成酶 | 催化 | 在FPS K197G突变菌株中表达，geraniol产量约3.3 mg/L，较空载体提高8.4倍 |
| Saccharomyces cerevisiae | 萜类前体合成 | ERG20 (FPS) | 法尼基焦磷酸合酶 (farnesyl diphosphate synthase) | 催化 | 突变K197G降低FPS活性，导致GPP积累，用于CrGES体内功能验证 |
| Catharanthus roseus | MIA生物合成-单萜分支 | CrGES | 香叶醇合成酶 | 催化 | 定位于质体基质和基质丝；在IPAP细胞中表达；受茉莉酸甲酯诱导 |
| Catharanthus roseus | MIA生物合成-单萜分支 | G10H | 香叶醇10-羟化酶 (geraniol 10-hydroxylase) | 催化 | 与CrGES在IPAP细胞共表达，催化geraniol生成10-羟基香叶醇；位于ER膜 |
| Catharanthus roseus | MIA生物合成调控 | ORCA3 | 转录因子 ORCA3 | 调控 | 受茉莉酸甲酯调控，激活MIA生物合成基因表达，用作MeJa处理阳性对照 |
关键发现
CrGES cDNA全长1770 bp，编码589个氨基酸，预测分子量67.7 kDa。重组CrGES催化GPP生成geraniol，Km值为58.5 μM。在酵母FPS K197G突变体中表达CrGES，geraniol产量约3.3 mg/L，比空载体提高8.4倍。CrGES与Lippia dulcis GES有64%同一性，与罗勒59%，与肉桂36%，与紫苏33%。茉莉酸甲酯处理4小时后CrGES转录本显著升高。CrGES与G10H在22个样品中的表达Pearson相关系数为0.977。原位杂交显示CrGES在IPAP细胞特异表达。
研究结论
研究结果表明CrGES是MIA途径单萜分支的关键起始酶，定位在质体，在IPAP细胞中表达，受茉莉酸甲酯诱导，其产物香叶醇可能通过基质丝与内质网的相互作用传递至下一个酶G10H，从而支持MIA合成途径的多细胞区室化组织。