Functional characterization of four sesquiterpene synthases from Ricinus communis (Castor bean)
- 作者
- Xinkai Xie, James Kirby, Jay D. Keasling
- 单位
- California Institute of Quantitative Biosciences (QB3), University of California, Berkeley; Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of California, Berkeley; Bioengineering, University of California, Berkeley; Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory; Joint BioEnergy Institute
- 杂志
- Phytochemistry（2012）
- DOI
- 10.1016/j.phytochem.2012.02.022
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从蓖麻（Ricinus communis）基因组中挖掘并鉴定胞质倍半萜合酶（SeTPS），因为此前尚未从该植物中分离到任何SeTPS基因。
研究策略
采用基因组挖掘策略，利用已知二萜合酶序列搜索蓖麻基因组，预测候选SeTPS基因；通过RT-PCR从叶片mRNA克隆cDNA，在工程化大肠杆菌和酿酒酵母中异源表达，结合体外酶活测定和系统发育分析进行功能表征。
核心内容
本研究从蓖麻（Ricinus communis）基因组中挖掘并鉴定了四个胞质倍半萜合酶基因（RcSeTPS1、5、7、10），这是首次从蓖麻及大戟科植物中克隆并功能表征此类酶。研究者利用已知二萜合酶序列搜索基因组，预测候选基因后经RT-PCR克隆cDNA，并在工程化大肠杆菌和酿酒酵母中异源表达，结合体外酶活测定和系统发育分析进行功能验证。结果显示，RcSeTPS1在酵母中同时产生(−)-α-copaene（约60%，9 mg/L）和(+)-δ-cadinene（约40%，6 mg/L），而RcSeTPS7特异性产生单一产物(E,E)-α-farnesene，在酵母中滴度达70 mg/L，在大肠杆菌中为12 mg/L。相比之下，其他植物来源的SeTPS在相同宿主中产量可达75–450 mg/L，远高于蓖麻酶，表明其在工程宿主中的表达效率较低。另有RcSeTPS5和RcSeTPS10仅在体外与FPP孵育时表现出多产物活性（包括倍半萜醇），体内却检测不到产物；RcSeTPS3和RcSeTPS13则形成包涵体而无活性。这些发现揭示了蓖麻SeTPS的功能多样性及异源表达局限性，为后续优化其微生物合成效率提供了基础。
创新点
首次从蓖麻及大戟科植物中克隆并功能表征了倍半萜合酶；发现RcSeTPS1能同时产生(−)-α-copaene和(+)-δ-cadinene两种产物，RcSeTPS7只产生(E,E)-α-farnesene；揭示蓖麻SeTPS在工程微生物宿主中的产量远低于其他植物来源的SeTPS，并发现有候选酶仅在体外有活性。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH1; Saccharomyces cerevisiae EPY300 | 倍半萜生物合成（甲羟戊酸途径） | RcSeTPS1 | RcSeTPS1 | 催化 | 产生(−)-α-copaene（约60%）和(+)-δ-cadinene（约40%） |
| Escherichia coli DH1; Saccharomyces cerevisiae EPY300; Escherichia coli BLR(DE3)（体外表达） | 倍半萜生物合成（甲羟戊酸途径） | RcSeTPS5 | RcSeTPS5 | 催化 | 仅在体外与FPP孵育时产生多种倍半萜烯和倍半萜醇 |
| Escherichia coli DH1; Saccharomyces cerevisiae EPY300 | 倍半萜生物合成（甲羟戊酸途径） | RcSeTPS7 | RcSeTPS7 | 催化 | 产生单一产物(E,E)-α-farnesene，酿酒酵母中滴度为70 mg/L，大肠杆菌中为12 mg/L |
| Escherichia coli DH1; Saccharomyces cerevisiae EPY300; Escherichia coli BLR(DE3)（体外表达） | 倍半萜生物合成（甲羟戊酸途径） | RcSeTPS10 | RcSeTPS10 | 催化 | 仅在体外与FPP孵育时产生多种倍半萜烯 |
| Escherichia coli DH1; Saccharomyces cerevisiae EPY300; Escherichia coli BLR(DE3) | 倍半萜生物合成（甲羟戊酸途径） | RcSeTPS3 | RcSeTPS3 | 催化 | 体内外均未检测到产物，形成包涵体；密码子优化后仍无活性 |
| Escherichia coli BLR(DE3) | 倍半萜生物合成（甲羟戊酸途径） | RcSeTPS13 | RcSeTPS13 | 催化 | 体内外均未检测到产物，形成包涵体 |
关键发现
- RcSeTPS1在酿酒酵母中产生(−)-α-copaene（约60%）和(+)-δ-cadinene（约40%），滴度分别为9 mg/L和6 mg/L，在大肠杆菌中分别为7 mg/L和3.5 mg/L
- RcSeTPS7产生单一产物(E,E)-α-farnesene，在酿酒酵母中滴度为70 mg/L，在大肠杆菌中为12 mg/L
- 其他植物来源的SeTPS在大肠杆菌中产量为75–450 mg/L，在酿酒酵母中为94–290 mg/L，均远高于蓖麻SeTPS
- RcSeTPS5和RcSeTPS10仅在体外与FPP孵育时产生多种倍半萜产物（RcSeTPS5还产生倍半萜醇），在体内未检测到产物
- RcSeTPS3和RcSeTPS13形成包涵体，无活性。
研究结论
利用基因组挖掘策略从蓖麻中分离的胞质倍半萜合酶被分析和功能表征。四个功能性萜类合酶确实是SeTPS，产生单一、双重和多种倍半萜产物。这是首次从该植物及大戟科中表征SeTPS。在工程大肠杆菌和酿酒酵母中，蓖麻SeTPS的体内表达产量显著低于其他植物SeTPS。两个RcSeTPS仅在体外有活性，可能由于宿主中低活性或低蛋白表达或两者兼有。