7-Deoxyloganetic acid synthase catalyzes a key 3 step oxidation to form 7-deoxyloganetic acid in Catharanthus roseus iridoid biosynthesis
- 作者
- Vonny Salim, Brent Wiens, Sayaka Masada-Atsumi, Fang Yu, Vincenzo De Luca
- 单位
- Department of Biological Sciences, Brock University, St. Catharines, Ontario, Canada
- 杂志
- Phytochemistry（2014）
- DOI
- 10.1016/j.phytochem.2014.02.009
- 所属领域
- 植物代谢工程 / 天然产物生物合成
- 关键词
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解决的核心问题
马钱苷（secologanin）生物合成途径中，由环烯醚萜醇（iridoidal-nepetalactol）氧化形成7-脱氧马钱苷酸（7-deoxyloganetic acid）羧基所必需的三步氧化反应一直未被表征，对应的酶基因（7DLS）未知。
研究策略
利用Phytometasyn数据库挖掘产secologanin植物中的候选细胞色素P450基因，通过病毒诱导基因沉默（VIGS）在长春花中筛选功能，再在酿酒酵母中异源表达验证酶活，并结合系统发育和表达分析进行注释。
核心内容
该研究鉴定了长春花中催化环烯醚萜醇（iridoidal-nepetalactol）连续三步氧化生成7-脱氧马钱苷酸的关键酶基因CYP76A26（7DLS），补齐了马钱苷生物合成途径中最后一个未被表征的酶学步骤。研究者利用Phytometasyn数据库挖掘候选细胞色素P450基因，通过病毒诱导基因沉默在长春花中筛选功能，并在酿酒酵母中异源表达验证酶活。酵母实验证实CYP76A26可将nepetalactol转化为7-脱氧马钱苷酸，转化率为8%–24%，并检测到微量iridotrial中间体，且该酶不作用于香叶醇、10-羟基香叶醇等底物。VIGS沉默CYP76A26使长春花叶片马钱苷水平降低60%，长春质碱和文多灵分别降低约50%和30%，沉默效率超过75%。表达分析显示该基因在幼叶中表达最高，整叶丰度比表皮高4倍。该研究完成了从香叶醇到马钱苷所需全部8个基因的鉴定，为在植物或微生物宿主中异源重构环烯醚萜和单萜吲哚生物碱途径提供了关键基因资源。
创新点
首次鉴定并功能表征了7-脱氧马苷酸合酶（CYP76A26），补齐了长春花马钱苷/单萜吲哚生物碱生物合成途径中最后一个关键酶；证实该酶催化环烯醚萜底物的连续三步氧化（醇→醛→酸）；为异源重构iridoid和MIA途径提供了关键基因。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus | Iridoid/secologanin biosynthesis | CYP76A26 (7DLS) | 7-deoxyloganetic acid synthase (7DLS) | 催化 | 催化nepetalactol三步氧化生成7-deoxyloganetic acid |
| Saccharomyces cerevisiae | 异源表达系统 | CYP76A26 (7DLS) | 7-deoxyloganetic acid synthase (7DLS) | 催化 | 在酵母中与CPR共表达，验证其三步氧化活性 |
| Catharanthus roseus | Iridoid/secologanin biosynthesis | G10H (CYP76B6) | geraniol 10-hydroxylase | 催化 | 上游基因，催化香叶醇羟基化 |
| Catharanthus roseus | Iridoid/secologanin biosynthesis | IRS | iridoid synthase | 催化 | 催化10-oxogeranial环化形成nepetalactol/iridodial |
| Catharanthus roseus | Iridoid/secologanin biosynthesis | DLGT | 7-deoxyloganetic acid glucosyltransferase | 催化 | 催化7-deoxyloganetic acid糖基化 |
| Catharanthus roseus | Iridoid/secologanin biosynthesis | DL7H (CYP72A224) | 7-deoxyloganic acid 7-hydroxylase | 催化 | 催化7-deoxyloganic acid羟基化生成loganic acid |
| Catharanthus roseus | Iridoid/secologanin biosynthesis | LAMT | loganic acid O-methyltransferase | 催化 | 催化loganic acid甲基化生成loganin |
| Catharanthus roseus | Iridoid/secologanin biosynthesis | SLS (CYP72A1) | secologanin synthase | 催化 | 催化loganin形成secologanin |
| Saccharomyces cerevisiae | P450电子传递系统 | CPR | NADPH-cytochrome P450 reductase | 能量供给 | 为7DLS提供还原当量 |
关键发现
- VIGS沉默CYP76A26使长春花叶片中马钱苷水平降低60%，主要单萜吲哚生物碱长春质碱（catharanthine）降低约50%，文多灵（vindoline）降低约30%
- 转录水平沉默效率>75%。酵母异源表达CYP76A26可将nepetalactol转化为7-脱氧马苷酸（7-deoxyloganetic acid），转化率为8%–24%，检测到微量iridotrial中间体
- 该酶不作用于香叶醇、10-羟基香叶醇、10-氧香叶醛等底物。表达分析显示7DLS在幼叶中表达最高，且在整叶中的丰度比表皮高4倍。
研究结论
CYP76A26编码真正的7-脱氧马苷酸合酶（7DLS），催化nepetalactol经三步氧化生成7-脱氧马苷酸，完成长春花中由香叶醇合成马钱苷所需的8个基因的鉴定，为在植物或微生物宿主中工程化生产iridoid和MIA类化合物奠定了基础。