Transcriptome profiling, and cloning and characterization of the main monoterpene synthases of Coriandrum sativum L.
- 作者
- Mariana Galata, Lukman S. Sarker, Soheil S. Mahmoud
- 单位
- Department of Biology, University of British Columbia Okanagan Campus, 3333 University Way, Kelowna, BC V1V 1V7, Canada
- 杂志
- Phytochemistry（2014）
- DOI
- 10.1016/j.phytochem.2014.02.016
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
芫荽（Coriandrum sativum）果实精油中主要单萜成分如(S)-芳樟醇和γ-萜品烯的生物合成机制尚不清楚，其关键萜烯合酶基因未被克隆和功能表征，限制了通过代谢工程或育种改良芫荽精油产量与品质的研究。
研究策略
利用Illumina高通量测序对芫荽果实三个发育阶段（早期、中期、晚期）进行转录组测序和从头组装，通过序列同源性和保守基序筛选出两个单萜合酶候选基因CsγTRPS和CsLINS，在大肠杆菌中异源表达并纯化重组蛋白，以香叶基二磷酸（GPP）为底物进行酶学功能测定，同时结合转录组表达谱分析关键萜类合成基因的表达动态。
核心内容
该研究通过Illumina高通量测序对芫荽果实三个发育阶段进行转录组分析，拼接获得65,306条转录本，并从中克隆了两个关键单萜合酶基因CsγTRPS和CsLINS。在大肠杆菌中异源表达并纯化重组蛋白后，以香叶基二磷酸为底物进行酶学表征，结果显示CsγTRPS催化产生γ-萜品烯（占产物91.1%）及少量桧烯和α-萜品烯，而CsLINS专一产生(S)-芳樟醇。精油成分分析表明(S)-芳樟醇占果实精油总量的78.96%，γ-萜品烯占2.66%，两者共同构成芫荽精油的主体。动力学测定显示CsLINS对底物的亲和力远高于CsγTRPS（Km分别为2.5 μM和66.25 μM），且催化效率高出两个数量级。转录表达分析发现(S)-芳樟醇合酶基因在果实中期表达量最高，较早期上调2倍。该研究首次为芫荽提供了转录组资源，明确了两大单萜合酶的催化功能与表达动态，为通过代谢工程或分子育种改良芫荽精油产量和品质奠定了基因基础。
创新点
首次构建了芫荽果实的转录组文库，并首次克隆和功能表征了两个主要单萜合酶基因CsγTRPS和CsLINS；明确了它们分别催化GPP生成γ-萜品烯和(S)-芳樟醇，共同构成芫荽精油的主体成分。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli Rosetta (DE3) pLysS | 单萜生物合成（MEP/DXP途径下游） | CsγTRPS | γ-萜品烯合酶 | 催化 | 去除N端信号肽后在细菌中表达，重组蛋白纯度由Ni-NTA纯化，催化GPP生成γ-萜品烯（91.1%）及多种次要单萜产物 |
| Escherichia coli Rosetta (DE3) pLysS | 单萜生物合成（MEP/DXP途径下游） | CsLINS | (S)-芳樟醇合酶 | 催化 | 重组表达并纯化，催化GPP单一产物(S)-芳樟醇，经手性柱确认产物为(S)异构体 |
| Coriandrum sativum（芫荽） | 萜类前体合成（DXP途径） | DXS (1-deoxyxylulose-5-phosphate synthase) 及 DXS2 | 脱氧木酮糖磷酸合酶 | 催化 | 转录组分析显示DXS表达较HMGR高约2倍，DXS2在S2到S3阶段转录本下降约2倍 |
| Coriandrum sativum（芫荽） | 萜类前体合成（MVA途径） | HMGR (HMG-CoA reductase) | HMG-CoA还原酶 | 催化 | 转录组分析显示HMGR表达相对恒定，提示MVA途径可能也参与精油合成 |
关键发现
- 转录组测序获得33,330,312条reads，拼接得到65,306条转录本
- 精油成分分析显示(S)-芳樟醇占78.96±2.86%，γ-萜品烯占2.66±1.34%
- CsγTRPS和CsLINS分别编码558和562个氨基酸蛋白，分子量为65.16 kDa和65.91 kDa
- CsγTRPS催化GPP产生γ-萜品烯（91.1%）、桧烯（6.97%）、α-萜品烯（1.18%）等，CsLINS则专一产生(S)-芳樟醇
- 动力学参数：CsγTRPS的Km=66.25±13.32 μM，Vmax=2.24±0.16 pkat/mg，kcat/Km=2.228×10^-6 s^-1 μM^-1
- CsLINS的Km=2.5±0.6 μM，Vmax=19.63±1.05 pkat/mg，kcat/Km=5.40×10^-4 s^-1 μM^-1
- 两者最适pH为6.0-6.5，最适温度30-35°C
- 转录表达分析显示(S)-芳樟醇合酶基因在中期（S2）表达量最高，较S1上调2倍，较S3下调5倍。
研究结论
CsLINS和CsγTRPS是负责芫荽果实精油中主要单萜（(S)-芳樟醇、γ-萜品烯及对伞花烃前体）合成的关键酶，研究结果首次为芫荽提供了转录组资源，有助于通过代谢工程或分子标记辅助育种改良芫荽精油的产量和品质。