β-Amyrin synthase (EsBAS) and β-amyrin 28-oxidase (CYP716A244) in oleanane-type triterpene saponin biosynthesis in Eleutherococcus senticosus
- 作者
- Hye-Jeong Jo, Jung Yeon Han, Hwan-Su Hwang, Yong Eui Choi
- 单位
- Department of Forest Resources, College of Forest and Environmental Sciences, Kangwon National University, Chuncheon 200-701, Republic of Korea
- 杂志
- Phytochemistry（2017）
- DOI
- 10.1016/j.phytochem.2016.12.011
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
刺五加齐墩果烷型三萜皂苷生物合成途径中两个关键酶（β-香树脂醇合酶和β-香树脂醇28-氧化酶）的功能鉴定与异源表达。
研究策略
基于刺五加叶片转录组学分析分离全长cDNA，通过酵母和烟草异源表达、GC/MS和LCMS-IT-TOF分析进行功能表征。
核心内容
本研究从刺五加叶片转录组中分离鉴定了齐墩果烷型三萜皂苷生物合成的两个关键酶基因：β-香树脂醇合酶EsBAS（ORF 2295 bp，编码769个氨基酸）和β-香树脂醇28-氧化酶CYP716A244（ORF 1446 bp，编码481个氨基酸）。通过酵母异源表达证实EsBAS可催化生成β-香树脂醇，而EsBAS与CYP716A244共表达则可产生齐墩果酸及中间产物erythrodiol，从而确定CYP716A244的功能为β-香树脂醇C-28位氧化酶。在转基因烟草中单独表达EsBAS，叶片中β-香树脂醇含量达到30–60 μg/g干重，且经1.0 mg/L 2,4-D处理后的愈伤组织中该产物积累量提高20倍以上；共表达两个基因的烟草叶片中齐墩果酸、erythrodiol和β-香树脂醇的总含量为5.4–19.1 μg/g干重。这是首次在转基因烟草中实现β-香树脂醇和齐墩果酸的生产，证明了该双酶系统可在植物底盘中进行功能重组，为齐墩果烷型三萜皂苷的异源生物合成提供了可行的策略。
创新点
首次在转基因烟草中实现β-香树脂醇和齐墩果酸的生产；鉴定了CYP716A244为β-香树脂醇28-氧化酶。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，erg7缺陷突变株） | 齐墩果烷型三萜皂苷生物合成 | EsBAS | β-香树脂醇合酶（β-amyrin synthase） | 催化 | 异源表达产生β-香树脂醇，GC/MS确认 |
| 酿酒酵母WAT21（表达拟南芥NADPH-细胞色素P450还原酶） | 齐墩果烷型三萜皂苷生物合成 | CYP716A244 | β-香树脂醇28-氧化酶（β-amyrin 28-oxidase） | 催化 | 与EsBAS共表达，催化β-香树脂醇C-28三歩氧化生成齐墩果酸 |
| 酿酒酵母WAT21 | 齐墩果烷型三萜皂苷生物合成 | 拟南芥NADPH-细胞色素P450还原酶（ATR1） | NADPH-cytochrome P450 reductase | 催化 | 为CYP716A244提供电子，共表达时所需 |
| 烟草（Nicotiana tabacum） | 齐墩果烷型三萜皂苷生物合成 | EsBAS | β-香树脂醇合酶（β-amyrin synthase） | 催化 | 过表达生产β-香树脂醇，叶片含量30-60 μg/g DW |
| 烟草（Nicotiana tabacum） | 齐墩果烷型三萜皂苷生物合成 | CYP716A244 | β-香树脂醇28-氧化酶（β-amyrin 28-oxidase） | 催化 | 与EsBAS共表达，叶片中齐墩果酸等含量5.4-19.1 μg/g DW |
关键发现
分离得到EsBAS（cDNA全长2738 bp，ORF 2295 bp，编码769个氨基酸，88.4 kDa）和CYP716A244（cDNA全长1721 bp，ORF 1446 bp，编码481个氨基酸，54.01 kDa）。酵母中异源表达EsBAS产生β-香树脂醇，GC/MS保留时间36.2 min，MS碎片218和189 m/z。共表达EsBAS和CYP716A244于酵母产生齐墩果酸、erythrodiol和β-香树脂醇。转基因烟草叶片中β-香树脂醇含量为30-60 μg/g DW，2,4-D（1.0 mg/l）处理后愈伤组织β-香树脂醇积累提高20倍以上。共表达双基因的转基因烟草叶片中齐墩果酸、erythrodiol和β-香树脂醇总含量为5.4-19.1 μg/g DW。
研究结论
EsBAS和CYP716A244分别是刺五加中β-香树脂醇合酶和β-香树脂醇28-氧化酶，两者共表达可在酵母和转基因烟草中合成齐墩果酸，为齐墩果烷型皂苷的异源生产提供了策略。