Changes in gene transcription and taxane production in elicited cell cultures of Taxus × media and Taxus globosa

作者: Karla Ramirez-Estrada, Lidia Osuna, Elisabeth Moyano, Mercedes Bonfill, Nadia Tapia, Rosa M. Cusido, Javier Palazon
单位: Laboratorio de Fisiologia Vegetal, Facultat de Farmacia, Universitat de Barcelona, Barcelona, Spain; Centro de Investigación Biomédica del Sur, Instituto Mexicano del Seguro Social, Morelos, Mexico; Departamento de Ciências Experimentais i de la Salut, Universitat Pompeu Fabra, Barcelona, Spain
杂志: Phytochemistry（2015）
DOI: 10.1016/j.phytochem.2015.06.013
所属领域: 植物代谢工程
关键词: Plant cell culturesTaxanesTaxolTaxus globosaTaxus × mediaTranscription profiles
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解决的核心问题

如何通过诱导子组合（环糊精CD和冠菌素CORO）提高新型红豆杉（Taxus globosa）和已广泛研究的Taxus × media细胞培养中紫杉烷（尤其紫杉醇）的产量，并解析相关基因转录与紫杉烷积累的关系。

研究策略

建立两阶段细胞培养体系，在第二阶段开始分别添加CD、CORO或二者组合，比较两种红豆杉细胞系的生长、总紫杉烷及个体紫杉烷产量，并通过qRT-PCR分析紫杉醇生物合成关键基因（TXS、T7βOH、DBAT、CoA ligase、BAPT、DBTNBT）的表达变化。

研究路线图

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核心内容

该研究在红豆杉（Taxus × media和Taxus globosa）细胞培养体系中，考察了环糊精（CD）与冠菌素（CORO）单独及联合添加对紫杉烷产量和关键生物合成基因转录的影响。两阶段培养中，CD+CORO联合处理使T. globosa总紫杉烷峰值产量较对照提高40倍以上，而单独CD和CORO仅提高5.3倍和1.6倍；T. media在联合处理下产量为对照的17.6倍。T. media总紫杉烷产量约为T. globosa的两倍，但后者超过90%的紫杉烷释放至培养基中。CORO抑制细胞生长（T. globosa降低53%，T. media降低20%），而CD可部分抵消该抑制。基因表达分析显示，TXS、DBAT、BAPT等基因在CORO或联合处理早期显著上调（如TXS在T. media中CORO处理12小时达对照的18.6倍，T. globosa中联合处理48小时增加超20倍），CoA ligase在联合处理4小时表达最高（为对照的6倍）。这些结果表明CD与CORO协同诱导紫杉烷积累，但效应具有物种依赖性，CoA ligase可能是紫杉醇生物合成的潜在限速靶点，为红豆杉代谢工程优化提供了新线索。

创新点

首次在Taxus globosa细胞培养中测试CD与CORO的单独及联合诱导效果；首次在CD+CORO联合处理条件下研究新近鉴定的β-苯丙氨酸CoA连接酶基因的表达；揭示了CD与CORO在紫杉烷生产中具有协同增效作用，且不同红豆杉物种在紫杉烷积累模式和基因转录响应上存在显著差异。

研究对象（12）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Taxus × media	紫杉醇生物合成	TXS	紫杉二烯合酶 (taxadiene synthase)	催化	催化GGPP环化为taxadiene，紫杉醇生物合成的第一个限速步骤
Taxus globosa	紫杉醇生物合成	TXS	紫杉二烯合酶 (taxadiene synthase)	催化	在T. globosa中表达水平极低，但与CD+CORO处理后24-48h表达上升超20倍
Taxus × media	紫杉醇生物合成	T7βOH	紫杉烷7β-羟化酶 (taxane 7β-hydroxylase)	催化	催化紫杉烷骨架7位羟基化
Taxus globosa	紫杉醇生物合成	T7βOH	紫杉烷7β-羟化酶 (taxane 7β-hydroxylase)	催化	在T. globosa中转录水平很低，仅在双诱导4h后检测到微量转录本
Taxus × media	紫杉醇生物合成	DBAT	10-去乙酰巴卡亭III-10-O-乙酰转移酶 (10-deacetylbaccatin III-10-O-acetyltransferase)	催化	催化10-脱乙酰巴卡亭III转化为巴卡亭III；CORO和CD+CORO处理12h后表达分别提高268%和295%
Taxus globosa	紫杉醇生物合成	DBAT	10-去乙酰巴卡亭III-10-O-乙酰转移酶 (10-deacetylbaccatin III-10-O-acetyltransferase)	催化	在T. globosa中表达极低，仅在CD+CORO处理4h后检测到微量
Taxus × media	紫杉醇生物合成	CoA ligase	β-苯丙氨酸CoA连接酶 (β-phenylalanine CoA ligase)	催化	催化β-苯丙氨酸生成β-苯丙氨酸CoA，为紫杉醇C13侧链前体；CD+CORO处理4h表达比CORO、CD和对照分别高3.2、8.7和6倍
Taxus globosa	紫杉醇生物合成	CoA ligase	β-苯丙氨酸CoA连接酶 (β-phenylalanine CoA ligase)	催化	在T. globosa中表达水平极低，仅在双诱导4h后检测到微量转录本
Taxus × media	紫杉醇生物合成	BAPT	巴卡亭III-3-氨基-13-苯丙酰转移酶 (baccatin III-3-amino-13-phenylpropanoyltransferase)	催化	催化C13侧链连接到巴卡亭III；CORO处理12h表达为对照的23倍
Taxus globosa	紫杉醇生物合成	BAPT	巴卡亭III-3-氨基-13-苯丙酰转移酶 (baccatin III-3-amino-13-phenylpropanoyltransferase)	催化	在T. globosa中表达极低，仅检测到痕量mRNA
Taxus × media	紫杉醇生物合成	DBTNBT	去苯甲酰基紫杉醇N-苯甲酰转移酶 (debenzoyl taxol N-benzoyl transferase)	催化	催化紫杉醇生物合成最后一步侧链苯甲酰化；CORO处理4h表达比CD+CORO、CD和对照分别高3、18.7和17.4倍
Taxus globosa	紫杉醇生物合成	DBTNBT	去苯甲酰基紫杉醇N-苯甲酰转移酶 (debenzoyl taxol N-benzoyl transferase)	催化	在T. globosa中表达可忽略不计

关键发现

CD+CORO联合处理使T. globosa总紫杉烷峰值产量比对照高40倍以上，而CD和CORO单独处理仅分别提高5.3倍和1.6倍
T. media在16天时CD+CORO、CORO、CD处理的总紫杉烷产量分别为对照的17.6倍、2.6倍和1.5倍。T. media的总紫杉烷产量是T. globosa的两倍多，但T. globosa中超过90%的紫杉烷释放到培养基中。CORO抑制细胞生长，T. globosa生长降低53%，T. media降低20%
CD使生物量增加1.2倍，并可部分抵消CORO的抑制作用（联合处理下T. globosa和T. media生长分别降低22%和14%）。T. globosa中主要紫杉烷为cephalomannine和10-deacetyltaxol，T. media中为taxol和baccatin III。基因表达方面，T. media中TXS在CORO处理后12h为对照的18.6倍，CD+CORO处理12h为12.5倍
T. globosa中TXS在CD+CORO处理48h后增加超过20倍。DBAT在CORO和CD+CORO处理12h分别比对照高268%和295%
CoA ligase在CD+CORO处理4h时表达量分别比CORO、CD和对照高3.2倍、8.7倍和6倍
BAPT在CORO处理12h为对照的23倍
DBTNBT在CORO处理4h时比CD+CORO、CD和对照分别高3倍、18.7倍和17.4倍。

研究结论

CD和CORO联合使用是提高红豆杉细胞培养中紫杉烷产量和向培养基排泄的有效策略，但效果具有物种依赖性。T. media的紫杉烷产量显著高于T. globosa，且高产量与紫杉醇生物合成基因的高转录水平密切相关；而T. globosa虽然基础产量低，但具有很强的胞外分泌能力，仍具有优化潜力。CoA ligase基因被鉴定为紫杉醇生物合成的一个可能限速步骤，为代谢工程改造提供了新靶点。