Homologous and heterologous expression of grapevine E-(β)-caryophyllene synthase (VvGwEcar2)

作者: Umberto Salvagnin, Silvia Carlin, Sergio Angeli, Urska Vrhovsek, Gianfranco Anfora, Mickael Malnoy, Stefan Martens
单位: Faculty of Science and Technology, Free University of Bozen-Bolzano; Research and Innovation Centre, Fondazione Edmund Mach
杂志: Phytochemistry（2016）
DOI: 10.1016/j.phytochem.2016.08.002
所属领域: 代谢工程
关键词: (E)-β-caryophylleneArabidopsis thalianaBrassicaceaeGenetic transformationGrapevineSesquiterpenesTPSTerpene synthaseVOCsVitaceaeVitis vinifera
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解决的核心问题

对葡萄中(E)-β-石竹烯合酶VvGwEcar2进行生化表征，并评估其在同源和异源植物中过表达对挥发性萜类排放的影响，以理解其生态功能并开发害虫防治策略。

研究策略

在大肠杆菌中异源表达并纯化VvGwEcar2，测定其产物谱和酶动力学参数；将该基因分别转入拟南芥和葡萄中稳定过表达，利用GC-MS分析挥发性有机物变化。

研究路线图

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核心内容

该研究对葡萄来源的(E)-β-石竹烯合酶VvGwEcar2进行了系统的生化表征，并评估了其在同源和异源植物中过表达对挥发性萜类排放的影响。研究者首先在大肠杆菌中异源表达并纯化了该酶，体外酶学测定显示其催化产物比例为β-caryophyllene:α-humulene:germacrene D=70:23.5:6.5，动力学参数Km为31.4 μM，kcat为0.19 s⁻¹，最适pH为7.8。随后将该基因分别转入拟南芥和葡萄中稳定过表达。在拟南芥中，转基因株系的E-β-caryophyllene释放量较野生型提高约8倍，达到39‒100 ng/株/天，并检测到thujopene的生成；而在葡萄中，尽管基因表达量增加了15‒370倍，E-β-caryophyllene排放仅从野生型的约5 ng/g鲜重提升至7‒20 ng/g，最高约4倍，且未检测到thujopene。值得注意的是，体外产物谱与体内不同，且基因表达水平与最终挥发性产量之间无直接相关性，表明萜类代谢通量在植物体内受到更精细的调控。该工作为理解植物-昆虫化学通讯机制以及开发基于半化学信息素的害虫治理策略奠定了重要基础。

创新点

首次完整表征了葡萄VvGwEcar2酶的动力学参数（Km=31.4 μM，kcat=0.19 s-1）；发现该酶在体外产生α-humulene和germacrene D，在植物体内则产生thujopene，表明不同环境中产物差异；在拟南芥和葡萄中过表达均提高了E-β-caryophyllene排放，但基因表达与产物量无直接相关性。

研究对象（3）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Escherichia coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL	Sesquiterpene biosynthesis (mevalonate pathway)	VvGwEcar2	(E)-β-caryophyllene synthase	催化	异源表达用于生化表征，产物包括E-β-caryophyllene、α-humulene和germacrene D，产量比例70:23.5:6.5
Arabidopsis thaliana Col-0	Sesquiterpene biosynthesis	VvGwEcar2	(E)-β-caryophyllene synthase	催化	异源表达，头部空间释放E-β-caryophyllene较对照提高8倍，并产生thujopene而非germacrene D
Vitis vinifera cv. Brachetto Grappolo Lungo	Sesquiterpene biosynthesis	VvGwEcar2	(E)-β-caryophyllene synthase	催化	同源表达，基因表达量增加15-370倍，E-β-caryophyllene释放从约5 ng/g增至7-20 ng/g，但表达量与产物量无显著相关性

关键发现

体外酶学表征显示VvGwEcar2产物比例为β-caryophyllene:α-humulene:germacrene D=70:23.5:6.5，Km为31.4 μM，kcat为0.19 s-1，kcat/Km为6.1 mM-1 s-1，最适pH 7.8。在拟南芥中过表达使E-β-caryophyllene释放量较Col-0提高8倍，绝对值范围为39-100 ng/株/天，并产生thujopene。在葡萄中过表达后，基因表达量增加15-370倍，但E-β-caryophyllene排放从野生型约5 ng/g鲜重增加到7-20 ng/g，最高4倍
α-humulene含量为0.5-1.5 ng/g。转基因葡萄中未检测到thujopene。

研究结论

本研究完成了VvGwEcar2的生化表征，并证明其在拟南芥和葡萄中过表达可增加E-β-caryophyllene的释放，但产物谱与体外不同，且基因表达量与最终挥发性产量无显著相关性，表明萜类代谢通量受更精细的调控。该工作为理解植物-昆虫化学通讯及开发基于半化学信息素的害虫治理策略提供了基础。