Bornyl-diphosphate synthase from Lavandula angustifolia: A major monoterpene synthase involved in essential oil quality
- 作者
- Yolande Despinasse, Sébastien Fiorucci, Serge Antonczak, Sandrine Moja, Aurélie Bony, Florence Nicolé, Sylvie Baudino, Jean-Louis Magnard, Frédéric Jullien
- 单位
- Université de Lyon, F-42023, Saint-Etienne, France; Université de Saint-Etienne, Jean Monnet, F-42000, Saint-Etienne, France; Laboratoire de Biotechnologies Végétales Appliquées aux Plantes Aromatiques et Médicinales, EA 3061, 23 Rue du Dr Michelon, F-42000, Saint-Etienne, France; Institut de Chimie de Nice, UMR-CNRS 7272, Faculté des Sciences, Université de Nice-Sophia Antipolis, 06108 Nice Cedex 2, France
- 杂志
- Phytochemistry（2017）
- DOI
- 10.1016/j.phytochem.2017.01.015
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并功能表征薰衣草（Lavandula angustifolia）的龙脑基二磷酸合酶（LaBPPS），阐明其在龙脑/樟脑生物合成中的催化作用与转录调控机制，为通过代谢工程或育种改良薰衣草精油品质提供靶点。
研究策略
从EST文库克隆LaBPPS，在大肠杆菌中异源表达并体外测定酶活；运用同源建模比较LaBPPS与鼠尾草SoBPPS的活性位点结构差异；通过qRT-PCR和GC-MS分析不同发育阶段叶片和花中LaBPPS转录水平与龙脑/樟脑积累的相关性；采用系统发育分析确定LaBPPS在TPSb家族中的进化位置。
核心内容
本研究从薰衣草EST文库中克隆了龙脑基二磷酸合酶基因LaBPPS，其开放阅读框编码602个氨基酸，预测分子量约70.6 kDa。在大肠杆菌中异源表达并进行体外酶活测定，结果表明LaBPPS在pH 6.5条件下主要产物为龙脑（30.2%），其次为α-蒎烯（23.6%）、莰烯（18.5%）和芳樟醇（10.7%），与鼠尾草SoBPPS以龙脑为主（57.8%）的产物谱存在显著差异。同源建模发现LaBPPS活性位点腔体积更大（780 ų对720 ų）且极性表面比例更高（58%对44%），这解释了其副产物更多的原因。qRT-PCR和GC-MS分析显示，LaBPPS转录水平在花发育早期最高而叶片中最低，龙脑和樟脑积累在花发育后期达到峰值，二者在转录水平呈正相关。系统发育分析将LaBPPS定位在TPSb分支基部，提示龙脑可能是薰衣草属最早合成的单萜之一。该研究明确了LaBPPS是薰衣草龙脑/樟脑生物合成的关键酶，其活性位点结构差异决定了产物多样性，为通过基因工程改良精油品质、降低樟脑含量提供了分子靶点。
创新点
首次克隆了薰衣草的龙脑基二磷酸合酶；发现LaBPPS与SoBPPS在氨基酸序列和产物分布上存在显著差异；通过分子建模揭示了活性位点体积和极性表面差异，解释了LaBPPS副产物更多的原因；证实LaBPPS表达与龙脑/樟脑积累在转录水平上正相关；系统发育显示LaBPPS位于TPSb分支基部，提示龙脑是薰衣草属早期合成的单萜。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli Rosetta (DE3) pLysS | 单萜生物合成（体外酶活检测） | LaBPPS (KM015221) | Bornyl-diphosphate synthase (LaBPPS) | 催化 | 重组表达LaBPPS，催化GPP生成龙脑基二磷酸（BPP），去磷酸化后得到龙脑，并可进一步氧化为樟脑；最适pH 6.5-7 |
| Lavandula angustifolia cv. Diva | 樟脑/龙脑生物合成途径 | LaBPPS | LaBPPS | 催化 | 体内负责合成龙脑/樟脑，表达随花发育阶段变化，与龙脑/樟脑积累呈正相关 |
| Salvia officinalis | 单萜生物合成途径 | SoBPPS | SoBPPS | 催化 | 作为对比酶，在相同条件下催化生成以龙脑（57.8%）为主的产物，活性位点腔体积和极性表面与LaBPPS不同 |
关键发现
- LaBPPS开放阅读框编码602个氨基酸，预测分子量约70.6 kDa，等电点4.92，与SoBPPS氨基酸同一性50%、相似性77%。体外酶活测定（pH 6.5）显示LaBPPS主要产物为龙脑（30.2±7.6%），其次为α-蒎烯（23.6±3.8%）、莰烯（18.5±2.8%）、芳樟醇（10.7±1.9%）、柠檬烯（8.9±2.3%）、β-蒎烯（8.0±1.4%）
- 而SoBPPS龙脑占57.8±9.6%，α-蒎烯12.5±4.4%，莰烯9.3±4.7%。LaBPPS活性位点腔体积为780 ų（SoBPPS为720 ų），极性表面比例58%（SoBPPS为44%）。qRT-PCR显示LaBPPS在叶片中表达最低，花序发育早期（S1-S2）表达最高，随后下降
- 龙脑/樟脑积累在花发育后期（S4-S5）达到峰值。系统发育分析表明LaBPPS处于TPSb分支根部。
研究结论
LaBPPS是薰衣草体内催化龙脑/樟脑生物合成起始步骤的关键酶，其表达受转录水平调控；活性位点结构差异是导致LaBPPS与SoBPPS产物谱不同的原因；LaBPPS在进化上保留祖先特征，龙脑可能是薰衣草属最早合成的单萜之一。这些发现为通过基因工程或标记辅助育种降低精油中樟脑含量、改良精油品质奠定了基础。