Review: Metabolic engineering and in vitro biosynthesis of phytochemicals and non-natural analogues
- 作者
- Mauricio Mora-Pale, Sandra P. Sanchez-Rodriguez, Robert J. Linhardt, Jonathan S. Dordick, Mattheos A.G. Koffas
- 单位
- Department of Chemical and Biological Engineering, Rensselaer Polytechnic Institute; Department of Biomedical Engineering, Rensselaer Polytechnic Institute; Department of Chemistry and Chemical Biology, Rensselaer Polytechnic Institute; Department of Material Science and Engineering, Rensselaer Polytechnic Institute; Department of Biology, Rensselaer Polytechnic Institute; Center for Biotechnology and Interdisciplinary Studies (CBIS), Rensselaer Polytechnic Institute
- 杂志
- Plant Science（2013）
- DOI
- 10.1016/j.plantsci.2013.05.005
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
植物天然产物及其非天然类似物在提取和化学合成中面临产量低、步骤多、异构体混杂等问题，需要开发高效的生物合成与多样化策略。
研究策略
综述了三种主要策略：微生物代谢工程、植物细胞代谢工程以及体外生物合成，并探讨了将代谢工程与体外生物催化相结合来生成非天然产物库。
核心内容
该综述系统梳理了微生物代谢工程、植物细胞代谢工程与体外生物合成三条策略在植物天然产物及其非天然类似物生产中的应用。通过代谢途径优化、基因敲除或过表达、染色体工程以及合成蛋白支架等手段，多平台产量得到显著提升：紫杉二烯在大肠杆菌中达约870 mg/L，酿酒酵母通过过表达甲羟戊酸途径使产量超过40 g/L；柚皮素与圣草酚的产量分别提高超过600%和400%。体外生物合成方面，利用酶催化非天然底物成功构建了结构多样的类似物库，例如10'-氟长春碱对敏感癌细胞株的IC50低至800 pM，活性较母体化合物增强8倍。综述指出，将代谢工程与体外生物催化有机结合，是提升产量和扩展化学空间的有效路径，未来需进一步优化酶稳定性与辅因子再生系统，以释放更多药用化合物的生物合成潜力。
创新点
系统整合了微生物、植物细胞和体外酶催化三种平台；强调利用非天然底物和组合生物催化产生新结构类似物；提出了代谢工程与体外生物催化联用的前景。
研究对象（40）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | MEP（甲基赤藓醇磷酸）途径 | dxs | DXS（1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶） | 催化 | 过表达以提高IPP前体供应 |
| Escherichia coli | MEP途径 | idi | IDI（异戊烯基二磷酸异构酶） | 催化 | — |
| Escherichia coli | MEP途径 | ispD | ISPD（2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸胞苷酰转移酶） | 催化 | — |
| Escherichia coli | MEP途径 | ispF | ISPF（2-C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环二磷酸合酶） | 催化 | — |
| Escherichia coli | 紫杉二烯生物合成 | — | GGPP合酶 | 催化 | 异源表达，与紫杉二烯合酶模块平衡 |
| Escherichia coli | 紫杉二烯生物合成 | — | 紫杉二烯合酶 | 催化 | 催化GGPP环化生成紫杉二烯 |
| Escherichia coli | 紫杉醇生物合成 | — | P450单加氧酶（5α-羟化酶） | 催化 | 催化紫杉二烯5α-氧化 |
| Saccharomyces cerevisiae | MVA（甲羟戊酸）途径 | — | 甲羟戊酸途径酶（如HMGR等） | 催化 | 过表达每个酶，amorpha-4,11-二烯产量>40 g/L |
| Escherichia coli | 异源MVA途径 | — | 甲羟戊酸途径酶（来自酵母） | 催化 | 实现amorpha-4,11-二烯产量27 g/L |
| Saccharomyces cerevisiae | 青蒿素前体生物合成 | ADS | amorpha-4,11-二烯合酶 | 催化 | 初始产量600 μg/L |
| Escherichia coli | 黄酮类生物合成 | chs | 查尔酮合酶（CHS） | 催化 | 催化丙二酰辅酶A和p-香豆酰辅酶A缩合 |
| Escherichia coli | 黄酮类生物合成 | chi | 查尔酮异构酶（CHI） | 催化 | — |
| Saccharomyces cerevisiae | 白藜芦醇生物合成 | TAL | 酪氨酸氨裂解酶（突变体） | 催化 | 密码子优化和定点突变，白藜芦醇产量提高约2.5倍 |
| Saccharomyces cerevisiae | 白藜芦醇生物合成 | 4CL216 | 4-香豆酰辅酶A连接酶 | 催化 | — |
| Saccharomyces cerevisiae | 白藜芦醇生物合成 | vst1 | 葡萄白藜芦醇合酶 | 催化 | — |
| Saccharomyces cerevisiae | 白藜芦醇生物合成 | — | 合成蛋白支架 | 区室化 | 通过小肽配体组织酶的空间分布，白藜芦醇产量提高2-6倍 |
| Salvia miltiorrhiza | 丹参酮生物合成 | SmHMGR | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | 过表达增强丹参酮产量 |
| Salvia miltiorrhiza | 丹参酮生物合成 | SmGGPPS | 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合酶 | 催化 | — |
| Salvia miltiorrhiza | 丹参酮生物合成 | SmDXS | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | — |
| Salvia miltiorrhiza | 丹参酮生物合成 | SmCPS | 柯巴基焦磷酸合酶 | 催化 | 催化GGPP转化为mil tiraidiene中间体 |
| Salvia miltiorrhiza | 丹参酮生物合成 | SmKSL | 贝壳杉烯合酶类似酶 | 催化 | — |
| Catharanthus roseus | 单萜吲哚生物碱 | RebH | 色氨酸卤化酶 | 催化 | 从土壤细菌引入，产生氯代色氨酸 |
| Catharanthus roseus | 单萜吲哚生物碱 | PyrH | 色氨酸卤化酶 | 催化 | — |
| Papaver somniferum | 吗啡生物合成 | codeinone reductase | 可待因酮还原酶 | 催化 | 过表达使阿片类产量提高约30% |
| Papaver somniferum | 吗啡生物合成 | CYP80B3 | (S)-N-甲基乌药碱3'-羟化酶 | 催化 | 过表达使总吗啡生物碱增加450% |
| Scutellaria baicalensis | 黄酮类生物合成 | CHI | 查尔酮异构酶 | 催化 | 过表达增加黄酮产量 |
| Zea mays | 苯丙烷/黄酮代谢 | ZmMYB31 | ZmMYB31转录因子 | 调控 | 抑制木质素合成，重定向代谢流至黄酮 |
| Arabidopsis thaliana | 苯丙烷途径 | TAL | 酪氨酸氨裂解酶（细菌来源） | 催化 | 异源表达增加花青素积累 |
| Lotus japonicus | 异戊烯基化多酚 | prenyltransferase | 异戊烯基转移酶（来自Streptomyces sp.和Sophora flavescens） | 催化 | 产生非天然的异戊烯基化多酚 |
| Vitis vinifera | 白藜芦醇生物合成 | STS | 白藜芦醇合酶（Stilbene synthase） | 催化 | 使用β-环糊精诱导，白藜芦醇产量600-4000 mg/L |
| 体外 | 三萜生物合成 | BARS1 | baruol合酶（来自拟南芥） | 催化 | 产生20多种氧化角鲨烯类似物 |
| 体外 | 三萜生物合成 | lanosterol synthase | 羊毛甾醇合酶（酵母突变体） | 催化 | 产生新三萜isomalabaricatrienol |
| 体外 | 倍半萜生物合成 | Cop1-Cop6 | 倍半萜合酶（来自Coprinus cinereus） | 催化 | 产生不同环化模式 |
| 体外 | 倍半萜生物合成 | γ-humulene synthase | γ-蛇麻烯合酶 | 催化 | 活性位点突变改变产物谱 |
| 体外 | 萜类生物合成 | FPPase | 法尼基焦磷酸合酶 | 催化 | 接受氯代底物产生非天然异戊二烯类似物 |
| 体外 | 多酚氧化 | SBP | 大豆过氧化物酶 | 催化 | 氧化apocynin和resveratrol产生活性低聚物 |
| 体外 | 黄酮糖基化 | DicGT4 | 糖基转移酶（来自Dianthus caryophyllus） | 催化 | 生成柚皮素-7-O-葡萄糖苷 |
| 体外 | 黄酮糖基化 | UGT78D1 | UDP-糖基转移酶 | 催化 | 对黄酮醇3位选择性糖基化 |
| 体外 | 叶黄素二酯水解 | lipase | 脂肪酶（Novozym 435, Lipozyme RM 1M） | 催化 | 在非水介质和SC-CO2中水解，异辛烷中转化率约85% |
| 体外 | 辣椒素类似物合成 | lipase | 脂肪酶（Lipozyme RM 1M） | 催化 | 在SC-CO2中合成N-香草基壬酰胺，产量>40%，添加二价盐增强活性 |
关键发现
- 通过CiED预测的基因敲除/过表达使柚皮素产量提高>600%，圣草酚提高>400%
- 通过DXP途径优化和染色体工程，紫杉二烯产量达~870 mg/L，为异源宿主最高值
- K衍生大肠杆菌菌株比B衍生菌株产紫杉二烯高2.5倍
- 在酵母中导入amorpha-4,11-二烯合酶产量600 μg/L，重组大肠杆菌经MVA途径产量27 g/L，酿酒酵母CEN.PK2过表达MVA途径产量>40 g/L
- 4-氯黄烷酮对大肠杆菌MIC=70 μg/mL（与PABN联用），对枯草芽孢杆菌MIC=20 μg/mL，对酿酒酵母和新型隐球菌MIC均为30 μg/mL
- 通过合成蛋白支架使白藜芦醇产量提高2-6倍，OptForce策略提高~60%
- 工业规模紫杉醇产量达900 mg/L
- 罂粟中过表达可待因酮还原酶使阿片类产量提高~30%，过表达CYP80B3使总吗啡生物碱增加450%
- 葡萄细胞培养用β-环糊精诱导白藜芦醇产量达600-4000 mg/L
- 白藜芦醇二聚体在2 μM浓度即可解聚β-淀粉样纤维，比单体白藜芦醇有效一个数量级
- 辣根过氧化物酶催化的长春碱二聚化产物catharinine的抗癌效果降低~77倍
- 叶黄素二酯在异辛烷中水解转化率~85%
- 在SC-CO2中合成N-香草基壬酰胺，添加CuCl2和ZnCl2（2 mM）使产量超过40%，酶活力保留超过50%
- 10'-氟长春碱对长春碱敏感HCT116 IC50=800 pM，对耐药HCT166/VM46 IC50=80 nM，细胞活性增强8倍。
研究结论
综述表明，通过微生物代谢工程、植物细胞代谢工程和体外生物合成能够有效生产植物天然产物及其非天然类似物，并且组合多种策略可显著提高产量和结构多样性；未来需要进一步优化酶稳定性和辅因子再生，并发展新的生物催化工具以生成更多具有药用潜力的化合物。