高级醇 · 代谢工程文献库

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Genetic mapping and characterization of the globe artichoke (+)-germacrene A synthase gene, encoding the first dedicated enzyme for biosynthesis of the bitter sesquiterpene lactone cyanropicrin

作者
Barbara Menin, Cinzia Comino, Ezio Portis, Andrea Moglia, Katarina Cankar, Harro J. Bouwmeester, Sergio Lanteri, Jules Beekwilder
单位
DIVAPRA, Plant Genetics and Breeding, University of Torino, via L. da Vinci 44, 10095 Grugliasco (TO), Italy; Plant Research International, P.O. Box 16, 6700 AA Wageningen, The Netherlands; Laboratory of Plant Physiology, Wageningen University, P.O. Box 658, 6700AR Wageningen, The Netherlands
杂志
Plant Science（2012）
DOI
10.1016/j.plantsci.2012.03.006
所属领域
植物代谢工程
关键词
(+)-Germacrene ACynara cardunculusCynaropicrinSesquiterpene lactonesTerpene synthase
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解决的核心问题

洋蓟(Cynara cardunculus)中苦味倍半萜内酯cyanropicrin的生物合成途径未知，其第一个关键酶(+)-germacrene A synthase的基因尚未被克隆和遗传定位。

研究策略

从约19,000条洋蓟unigene中鉴定候选GAS基因，通过全长cDNA扩增和异源表达于E. coli验证酶活；利用RT-qPCR分析不同组织中的表达水平，通过LC-MS定量cyanropicrin和酚类物质；检测亲本间序列多态性(SNP)，在F1作图群体中进行连锁分析，将基因定位到遗传图谱。

研究路线图

100%
研究问题：洋蓟苦味物质cyanropicrin合成首步酶基因未知
策略：从19,000条unigene中鉴定候选GAS基因
功能验证：全长cDNA克隆与E. coli异源表达
酶活检测：GC-MS鉴定产物β-elemene（(+)-germacrene A）
表达分析：RT-qPCR揭示组织特异性表达模式
代谢检测：LC-MS定量cyanropicrin与酚类物质
基因定位：SNP标记在F1群体中连锁分析
核心发现：CcGAS基因克隆、功能验证、表达相关性与遗传定位
结论：CcGAS参与cyanropicrin首步合成，为分子育种提供基础
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核心内容

本研究从约19,000条洋蓟unigene中鉴定出(+)-germacrene A synthase候选基因CcGAS，通过全长cDNA扩增并在大肠杆菌中异源表达验证了其催化功能。该基因ORF长1791 bp，编码560个氨基酸，重组酶催化FPP环化生成(+)-germacrene A（其Cope重排产物β-elemene在12.50 min处被检出）。RT-qPCR分析显示，CcGAS在6周龄成熟叶中表达最高，比20周龄老叶高640倍，在愈伤组织和花托中分别约为老叶的4倍和9倍，苞片中无表达。LC-MS定量表明，cyanropicrin含量以老叶最高，成熟叶为69、愈伤组织为11、花托为3、外苞片为0（相对标准化值），与酚类化合物的积累模式明显不同，支持CcGAS参与cyanropicrin生物合成第一步。通过检测亲本间SNP并在F1群体中进行连锁分析，将CcGAS定位到Altilis 41图谱连锁群Alt.5，位于AFLP标记e33/t89-510和e39/m50-410之间，与consensus SSR连锁群LG10对应。该基因的克隆与遗传定位为洋蓟苦味和药用性状的分子育种提供了直接靶点。

创新点

首次从洋蓟中分离并功能验证了(+)-germacrene A synthase基因（CcGAS），证明其催化FPP环化生成(+)-germacrene A，并将其定位到Cynara cardunculus遗传图谱。

研究对象（2）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli BL21(A1) 倍半萜内酯生物合成 CcGAS (+)-germacrene A synthase 催化 异源表达CcGAS，以FPP为底物催化生成(+)-germacrene A
Cynara cardunculus (globe artichoke) 倍半萜内酯生物合成 CcGAS (+)-germacrene A synthase 催化 在成熟叶中表达量最高，与cyanropicrin积累相关；SNP被定位到连锁群Alt.5/LG10

关键发现

  1. 从约19,000条unigene中鉴定出GAS基因，ORF长1791 bp，编码560个氨基酸，预测分子量64.5 kDa
  2. 异源表达CcGAS的酶反应生成β-elemene（(+)-germacrene A的Cope重排产物），保留时间12.50 min
  3. GAS表达在成熟叶（6周龄）中最高，比老叶（20周龄）高640倍，在愈伤组织和花托中分别比老叶高约4倍和9倍，苞片中未检出表达
  4. cyanropicrin含量以老叶最高（100），成熟叶为69，花托为3，外苞片为0，愈伤组织为11（相对标准化值）
  5. 酚类化合物（绿原酸、二咖啡酰奎宁酸、木犀草素糖苷等）的积累模式与cyanropicrin明显不同
  6. 在GAS基因第603位发现一个SNP，该标记被定位到Altilis 41图谱的连锁群Alt.5，位于AFLP标记e33/t89-510和e39/m50-410之间
  7. 该连锁群共12个标记，遗传长度55.1 cM，平均标记间距4.82 cM
  8. 与consensus SSR连锁群LG10比对，GAS位于微卫星标记aCELMS-14和rCyEM-214之间。

研究结论

研究结果支持CcGAS参与cyanropicrin生物合成的第一步，GAS表达与cyanropicrin积累呈正相关，组织分布特异；该基因的遗传定位为洋蓟苦味和药用性状的分子育种提供了基础。