Cloning and characterization of a p-cymeen monooxygenase from Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens
- 作者
- Tapan K. Dutta, Joydeep Chakraborty, Madhumita Roy, Debajyoti Ghosal, Pratick Khara, Irwin C. Gunsalus
- 单位
- Department of Microbiology, Bose Institute, Kolkata, India; NHEERL, Gulf Ecology Division, U.S. EPA, Gulf Breeze, FL, USA
- 杂志
- Research in Microbiology（2010）
- DOI
- 10.1016/j.resmic.2010.10.008
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明p-cymene单加氧酶系统的组成，特别是小蛋白CymB在p-cymene甲基羟基化中的作用。
研究策略
通过克隆和测序获得cymM和cymB基因，进行序列同源性分析；在E. coli中异源表达全长cymMBA与部分截短的cymB基因，利用HPLC和GC-MS检测底物转化产物及转化速率，比较催化活性差异。
核心内容
该研究从 Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens 中克隆并鉴定了 p-cymene 单加氧酶系统的两个关键基因 cymM 和 cymB，并在大肠杆菌 JM109 中异源表达全长及截短的 cymB 版本。序列分析显示 CymM 与恶臭假单胞菌 F1 的 CymAa 有 81.6% 的氨基酸同一性。通过 HPLC 和 GC-MS 检测底物转化，全长 cymMBA 表达菌株可将 p-cymene 转化为对异丙基苯甲醇（61%）、对异丙基苯甲醛（12.5%）和对异丙基苯甲酸（26.5%），转化速率为 7.6 nmol/(μg CDW·h)。而截短 cymB 的菌株总产物量仅为前者的 14.7%，转化速率降至 1.1 nmol/(μg CDW·h)，羟基化能力下降 85%。结果表明 p-cymene 单加氧酶是一个由 CymM、CymB 和 CymA 组成的三组分系统，其中 CymB 虽无可识别保守结构域，却作为增强子/激活子对高效甲基羟基化至关重要。
创新点
首次报道CymB蛋白（无可识别保守结构域）作为增强子/激活子参与p-cymene甲基羟基化，其缺失导致85%的羟基化能力下降。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli JM109 | p-cymene降解途径 | cymM | CymM | 催化 | 末端氧合酶组分，非血红素双铁酶，含8个保守组氨酸残基铁结合基序，与P. putida F1 CymAa有81.6%同源性 |
| Escherichia coli JM109 | p-cymene降解途径 | cymB | CymB | 调控 | 小蛋白（164 aa），无已知保守结构域，作为增强子/激活子，截短后使p-cymene羟基化能力下降85% |
| Escherichia coli JM109 | p-cymene降解途径 | cymA | CymA | 能量供给 | NADH依赖的细胞色素c还原酶，为羟基化反应提供还原力 |
| Pseudomonas chlororaphis subsp. aureofaciens | p-cymene降解途径 | cymM, cymB, cymA | CymM/CymB/CymA | 催化 | 原始菌株，以p-cymene为唯一碳源，含有完整的p-cymene单加氧酶系统 |
关键发现
- cymB基因长495 bp，编码164个氨基酸（17.3 kDa）
- cymM基因长1128 bp，编码375个氨基酸（42.9 kDa）。CymM与P. putida F1的CymAa有81.6%的氨基酸同一性，与XylM有37.2%同一性，与AlkB有24.8%同一性。重组E. coli JM109(pTD103)转化p-cymene生成p-cumic alcohol（61%）、p-cumic aldehyde（12.5%）和p-cumic acid（26.5%）
- pTD104（截短cymB）总产物量仅为pTD103的14.7%，产物比例为73.5% alcohol、8.2% aldehyde、18.3% acid。pTD103和pTD104的转化速率分别为7.6和1.1 nmol/(μg CDW·h)，即羟基化能力下降85%。
研究结论
p-cymene单加氧酶是一个三组分系统（CymM、CymB、CymA），其中CymB虽无保守结构域，但对高效甲基羟基化至关重要，作为增强/激活蛋白发挥作用。