Metabolic engineering for microbial production of shikimic acid
- 作者
- Marco Kramer, Johannes Bongaerts, Roel Bovenberg, Susanne Kremer, Ulrike Müller, Sonja Orf, Marcel Wubbolts, Leon Raeven
- 单位
- DSM Biotech GmbH, Karl-Heinz-Beckurts-Straße 13, D-52428 Jülich, Germany
- 杂志
- Metabolic Engineering（2003）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2003.09.001
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
莽草酸是合成抗流感药物达菲的关键手性原料，传统从八角果实提取成本高、难以规模化，需要开发可持续、经济的发酵生产方法。
研究策略
通过对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和柠檬酸杆菌进行代谢工程改造，阻断莽草酸下游代谢（如敲除aroK/aroL或aroA），同时改造中心碳代谢以增加前体PEP和E4P供给，并减少副产物（奎尼酸和脱氢莽草酸）的形成。
研究路线图
核心内容
针对莽草酸这一合成抗流感药物达菲的关键手性原料，该研究系统评估了多种代谢工程策略以提高微生物发酵产量。研究比较了两种生产策略：一种阻断莽草酸激酶（aroK/aroL），另一种阻断EPSP合酶（aroA）以截留莽草酸及其上游代谢物。在此基础上，通过替换磷酸转移酶系统为葡萄糖激酶途径、过表达转酮醇酶和PEP合酶等方式强化前体磷酸烯醇式丙酮酸和赤藓糖-4-磷酸的供给。结果表明，最佳大肠杆菌工程菌株在10-L发酵罐中莽草酸产量达84 g/L，产率为0.33 mol/mol葡萄糖；单独过表达转酮醇酶使产量从38 g/L提高至52 g/L，过表达PEP合酶进一步将产量提升至66 g/L；利用烟草双功能酶AroD·AroE实现底物通道效应，显著减少了奎尼酸和脱氢莽草酸等副产物的积累。该研究证实，敲除莽草酸激酶并强化前体供给是大肠杆菌高产莽草酸的最优组合策略，为达菲的可持续工业化生产提供了可行路径。
创新点
系统比较了莽草酸激酶缺陷型和EPSP合酶缺陷型两种生产策略；通过替换PTS系统、过表达转酮醇酶和PEP合酶显著提高PEP和E4P供给；利用底物通道（烟草aroD·E双功能酶）减少副产物；敲除shiA转运蛋白等。
研究对象（20）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 莽草酸途径 | aroF | DAHP合酶（酪氨酸敏感型） | 催化 | 受L-酪氨酸反馈抑制，存在反馈抗性突变体aroFbr |
| Escherichia coli | 莽草酸途径 | aroG | DAHP合酶（苯丙氨酸敏感型） | 催化 | 受L-苯丙氨酸反馈抑制 |
| Escherichia coli | 莽草酸途径 | aroH | DAHP合酶（色氨酸敏感型） | 催化 | 受L-色氨酸反馈抑制 |
| Escherichia coli | 莽草酸途径 | aroB | 脱氢奎尼酸合酶 | 催化 | 催化DAHP转化为DHQ，限速酶之一，过表达可提高通量 |
| Escherichia coli | 莽草酸途径 | aroD | 3-脱氢奎尼酸脱水酶 | 催化 | 催化DHQ转化为DHS |
| Escherichia coli | 莽草酸途径 | aroE | 莽草酸脱氢酶 | 催化 | 催化DHS还原为莽草酸，受莽草酸反馈抑制；过表达会同时产生奎尼酸副产物 |
| Escherichia coli | 莽草酸途径 | aroK | 莽草酸激酶I | 催化 | 与aroL共同催化莽草酸磷酸化为S3P；敲除可积累莽草酸 |
| Escherichia coli | 莽草酸途径 | aroL | 莽草酸激酶II | 催化 | 与aroK共同催化莽草酸磷酸化为S3P；敲除可积累莽草酸，过表达可增加S3P合成 |
| Escherichia coli | 莽草酸途径 | aroA | EPSP合酶 | 催化 | 催化S3P与PEP缩合为EPSP；缺陷株可积累S3P并分泌，脱磷酸后生成莽草酸 |
| Escherichia coli | 莽草酸途径 | shiA | 莽草酸转运蛋白 | 转运 | 负责摄取莽草酸，敲除可减少副产物，但存在其他转运系统 |
| Escherichia coli | 中心碳代谢（莽草酸前体供给） | tktA | 转酮醇酶 | 催化 | 增加E4P供给，提高莽草酸产量和产率 |
| Escherichia coli | 中心碳代谢（莽草酸前体供给） | ppsA | PEP合酶 | 催化 | 将丙酮酸转化为PEP，增加PEP供给，提高莽草酸产量 |
| Escherichia coli | 糖转运（莽草酸前体供给） | glf | 葡萄糖转运蛋白（Zymomonas mobilis） | 转运 | 与glk构成ATP依赖的葡萄糖摄取系统，替换PTS以节约PEP |
| Escherichia coli | 糖代谢（莽草酸前体供给） | glk | 葡萄糖激酶（Zymomonas mobilis） | 催化 | 磷酸化葡萄糖，与glf协同作用；不引入时仅靠内源葡萄糖激酶 |
| Escherichia coli | 莽草酸途径 | aroD·E | 双功能DHQ脱水酶/莽草酸脱氢酶（Nicotiana tabacum） | 催化 | 底物通道作用，减少奎尼酸生成，但DHS积累仍显著 |
| Bacillus subtilis | 莽草酸途径 | aroI | 莽草酸激酶 | 催化 | B. subtilis中仅一个莽草酸激酶基因，敲除可积累莽草酸 |
| Bacillus subtilis | 莽草酸途径 | aroA(G) | DAHP合酶 | 催化 | 受分支酸反馈抑制，来源于B. subtilis |
| Bacillus subtilis | 莽草酸途径 | aroE | 莽草酸脱氢酶（Bacillus amyloliquefaciens） | 催化 | 过表达可提高莽草酸产量并降低DHS比例 |
| Bacillus subtilis | 莽草酸途径 | aroD | DHQ脱水酶 | 催化 | 染色体整合以稳定表达 |
| Bacillus subtilis | 莽草酸途径 | aroA | EPSP合酶 | 催化 | 缺陷后积累S3P并脱磷酸产生莽草酸 |
关键发现
- 最佳大肠杆菌工程菌通过PTS替换（glf/glk）和tktA过表达，在10-L发酵罐中莽草酸产量达84 g/L，产率0.33 mol/mol葡萄糖
- 添加甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷使莽草酸滴度从28 g/L增至35 g/L，产率从0.14提高至0.19 mol/mol
- 过表达tktA使莽草酸产量从38 g/L提高至52 g/L，产率从0.12提高至0.18 mol/mol
- 过表达ppsA使产量达66 g/L，产率0.23 mol/mol
- 敲除aroK/aroL的大肠杆菌原代菌株产量27 g/L，副产物DHS 4.4 g/L、奎尼酸12.6 g/L
- 枯草芽孢杆菌aroI缺陷株经改造后莽草酸达19.7 g/L
- EPSP合酶缺陷大肠杆菌48 h莽草酸+S3P达20 g/L，DHS比例降至0.15±0.02 mol/mol碳。
研究结论
代谢工程为莽草酸的微生物发酵生产提供了有效途径，最佳策略为改造大肠杆菌的莽草酸激酶缺陷并强化前体供给，实现了高产率（0.33 mol/mol）和高浓度（84 g/L）的莽草酸生产，为达菲的工业化合成提供了可持续原料。