Evolution of a Saccharomyces cerevisiae metabolic pathway in Escherichia coli
- 作者
- Isabelle Meynial Salles, Nynne Forchhammer, Christian Croux, Laurence Girbal, Philippe Soucaille
- 单位
- Laboratoire de Biotechnologie- Bioprocédés (LBB), UMR- INSA/CNRS 5504, UMR INSA/INRA 792, 135 avenue de Rangueil, 31077 Toulouse cedex 4, France; Genencor International, 925 Page Mill Road, Palo Alto, CA, USA
- 杂志
- Metabolic Engineering（2006）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2006.09.002
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何在异源宿主大肠杆菌中通过体内进化快速提高酿酒酵母甘油途径的效率，从而高效生产甘油？
研究策略
通过敲除大肠杆菌的tpiA、mgsA和edd基因，使葡萄糖的代谢必须依赖甘油合成，从而施加强烈的选择压力；在恒化培养中进行连续进化，筛选高甘油生产菌株，并对进化后的途径进行生化表征。
核心内容
该研究旨在通过体内进化策略，在大肠杆菌中高效生产甘油。研究者敲除大肠杆菌的tpiA、mgsA和edd基因，使葡萄糖代谢必须依赖外源甘油合成途径，从而施加强烈选择压力；随后在恒化培养中连续进化，筛选高甘油生产菌株。进化过程中，质粒上GPD1和GPP2之间自发发生44 bp缺失和1个碱基插入，形成编码约70 kDa融合蛋白的融合基因。生化表征显示，融合蛋白的GPD1活性催化效率为3.6×10^5 s/M，是单独酶的2.25倍；体外耦合反应中，融合蛋白的瞬态时间仅10 s，而单独酶混合物需75 s，表明存在部分底物通道效应，使胞内甘油-3-磷酸稳态浓度从1.8 mM降至0.5 mM。进化后菌株最大比生长速率从0.17 h^-1提升至0.35 h^-1，补料分批发酵中甘油产量超过130 g/L，得率1.0 mol/mol，而对照菌株仅产70 g/L且副产乙酸24 g/L。该工作展示了通过中心代谢改造与进化筛选快速优化异源途径的通用策略。
创新点
首次通过体内进化自发产生GPD1-GPP2融合蛋白，该融合蛋白具有部分底物通道效应，提高了代谢通量；展示了通过中心代谢工程和进化筛选获得高效菌株的通用策略。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli MG1655 | 糖酵解/中心代谢 | tpiA | 磷酸丙糖异构酶 | 催化 | 被敲除以阻断DHAP与GAP的互变，强制甘油生成 |
| Escherichia coli MG1655 | 甲基乙二醛合成 | mgsA | 甲基乙二醛合酶 | 催化 | 敲除以避免DHAP转化为甲基乙二醛的毒性 |
| Escherichia coli MG1655 | Entner-Doudoroff途径 | edd | 6-磷酸葡萄糖酸脱水酶 | 催化 | 敲除以阻止非甘油途径代谢葡萄糖 |
| Escherichia coli MG1655 | 甘油合成途径 | GPD1 | 甘油-3-磷酸脱氢酶 | 催化 | 来自酿酒酵母，引入的异源基因，催化DHAP还原为G3P |
| Escherichia coli MG1655 | 甘油合成途径 | GPP2 | 甘油-3-磷酸磷酸酶 | 催化 | 来自酿酒酵母，引入的异源基因，催化G3P去磷酸化生成甘油 |
| Escherichia coli MG1655 | 甘油合成途径 | GPD1-GPP2融合基因 | GPD1-GPP2融合蛋白 | 催化 | 进化产生的融合蛋白，具有G3P脱氢酶和磷酸酶双活性，且部分底物通道效应 |
关键发现
- ['原始菌株的最大比生长速率为0.17±0.02 h^-1，进化后分离菌株的最大比生长速率达到0.35±0.04 h^-1，提升超过2倍
- ', '在恒化培养进化过程中，pS3质粒上GPD1和GPP2之间发生44 bp缺失和1个碱基插入，导致GPD1-GPP2融合基因，编码约70 kDa（SDS-PAGE实测62 kDa）的融合蛋白
- ', '融合蛋白的GPD1活性Km为0.17±0.04 mM，kcat为0.61±0.15×10^2 s^-1，催化效率3.6×10^5 s/M
- 而单独的GPD1 Km为0.36±0.09 mM，kcat为0.56±0.16×10^2 s^-1，催化效率1.6×10^5 s/M
- ', '融合蛋白的GPP2活性Km为6.4±1.4 mM，kcat为2.1±0.3×10^2 s^-1
- 单独的GPP2 Km为2.9±0.6 mM，kcat为1.6±0.2×10^2 s^-1
- ', '体外耦合反应中，融合蛋白的瞬态时间τ为10 s，稳态G3P浓度为0.3 mM，而单独酶混合物的τ为75 s，G3P稳态浓度为1.6 mM
- 融合蛋白的磷酸生成速率为0.011 mM/s，单独酶为0.0058 mM/s
- ', '体内恒化培养时，含融合蛋白的菌株胞内G3P浓度为0.5±0.2 mM，而含单独酶的菌株为1.8±0.4 mM
- ', '进化后的菌株在补料分批发酵中甘油产量超过130 g/L，甘油对葡萄糖的得率为1.0 mol/mol，整体甘油生产率为0.68 g/L/h（约16 g/L/d），乙酸浓度低于1 g/L
- ', '对照菌株（含单独GPD1和GPP2）在相同条件下甘油产量为70 g/L，且副产乙酸24 g/L。']
研究结论
本研究表明，通过改造大肠杆菌中心代谢使其生长严格依赖于目标途径，并在恒化培养中施加选择压力，可以快速进化异源途径。进化过程中自发产生的GPD1-GPP2融合蛋白由于部分底物通道效应，降低了G3P稳态浓度，显著提高了甘油合成通量，最终获得一株高产甘油的工程菌株，其性能可与通过代谢工程优化的酿酒酵母菌株相媲美。