Metabolic engineering of Escherichia coli for 1-butanol production
- 作者
- Shota Atsumi, Anthony F. Cann, Michael R. Connor, Claire R. Shen, Kevin M. Smith, Mark P. Brynildsen, Katherine J.Y. Chou, Taizo Hanai, James C. Liao
- 单位
- Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of California, Los Angeles, CA 90095, USA
- 杂志
- Metabolic Engineering（2007）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2007.08.003
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
大肠杆菌天然不产 1-丁醇，需在其非天然宿主中构建并优化 1-丁醇合成途径，以克服梭菌发酵的产物混杂、生长缓慢、遗传操作困难等问题。
研究策略
将丙酮丁醇梭菌的 1-丁醇合成途径（thl/hbd/crt/bcd/etfAB/adhE2）导入大肠杆菌，利用双质粒系统表达；比较不同来源的同工酶（如 atoB 替代 thl）；敲除竞争副产物途径（ldhA、adhE、frdBC、pta、pflB、fnr）以增加乙酰-CoA 和 NADH 供给；并通过优化有氧/厌氧条件和培养基提高产量。
核心内容
针对大肠杆菌天然不产1-丁醇的问题，该研究将丙酮丁醇梭菌的1-丁醇合成途径（thl/hbd/crt/bcd/etfAB/adhE2）导入大肠杆菌，利用双质粒系统实现异源表达。通过比较同工酶发现，用大肠杆菌内源atoB替代梭菌thl可使产量提高超过3倍；鉴于AdhE2对丁酰-CoA/乙酰-CoA的活性比（1.52）远高于大肠杆菌内源AdhE（0.25），选择adhE2作为终点酶。在此基础上，逐步敲除竞争副产物途径基因以增加乙酰-CoA和NADH供给，其中敲除adhE、ldhA、frdBC使产量翻倍，同时敲除pta和fnr后产量达373 mg/L，约为初始菌株的3倍。进一步优化培养条件发现，半有氧条件与富培养基显著促进生产，在TB培养基中添加甘油后产量升至552 mg/L，是M9培养基（113 mg/L）的近5倍；而敲除pflB几乎完全抑制生产，证实在厌氧条件下Pfl是乙酰-CoA的主要来源。该研究首次在大肠杆菌中实现1-丁醇生产，并确认其可耐受1.5%（v/v）丁醇，表明非天然且遗传操作便利的宿主具备生产生物丁醇的潜力，为后续代谢工程优化奠定了重要基础。
创新点
首次在大肠杆菌中实现 1-丁醇生产；利用大肠杆菌内源 atoB 替代梭菌 thl 显著提高产量；通过组合敲除 pta 与 fnr 使产量提高近 3 倍；发现半有氧条件和富培养基可有效提高丁醇产量。
研究对象（16）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 1-丁醇生物合成途径 | atoB | AtoB | 催化 | 乙酰-CoA 乙酰转移酶，用于替代 thl 提高产量 |
| Escherichia coli | 1-丁醇生物合成途径 | thl | Thl | 催化 | 乙酰乙酰-CoA 硫解酶，来自 C. acetobutylicum |
| Escherichia coli | 1-丁醇生物合成途径 | hbd | Hbd | 催化 | 3-羟基丁酰-CoA 脱氢酶，来自 C. acetobutylicum |
| Escherichia coli | 1-丁醇生物合成途径 | crt | Crt | 催化 | 巴豆酸酶，来自 C. acetobutylicum |
| Escherichia coli | 1-丁醇生物合成途径 | bcd | Bcd | 催化 | 丁酰-CoA 脱氢酶，来自 C. acetobutylicum，与 EtfAB 共同作用 |
| Escherichia coli | 1-丁醇生物合成途径 | etfAB | EtfA/EtfB | 催化 | 电子转移黄素蛋白，来自 C. acetobutylicum，参与 Bcd 催化反应 |
| Escherichia coli | 1-丁醇生物合成途径 | adhE2 | AdhE2 | 催化 | NADH 依赖的醛/醇脱氢酶，来自 C. acetobutylicum，将丁酰-CoA 还原为 1-丁醇 |
| Escherichia coli | 1-丁醇生物合成途径 | ccr | Ccr | 催化 | 巴豆酰-CoA 还原酶，来自 S. coelicolor，不需 Etf，尝试替代 Bcd/Etf |
| Escherichia coli | 1-丁醇生物合成途径 | bcd | Bcd | 催化 | 短链酰-CoA 脱氢酶，来自 M. elsdenii，与 etfAB 一起表达 |
| Escherichia coli | 1-丁醇生物合成途径 | etfAB | EtfA/EtfB | 催化 | 电子转移黄素蛋白，来自 M. elsdenii |
| Escherichia coli | 副产物代谢途径（乙醇） | adhE | AdhE | 催化 | 乙醛/醇脱氢酶，参与乙醇生成，被敲除以减少副产物 |
| Escherichia coli | 副产物代谢途径（乳酸） | ldhA | LdhA | 催化 | 乳酸脱氢酶，被敲除 |
| Escherichia coli | 副产物代谢途径（琥珀酸） | frdBC | FrdB/FrdC | 催化 | 延胡索酸还原酶亚基，被敲除以减少琥珀酸 |
| Escherichia coli | 副产物代谢途径（乙酸） | pta | Pta | 催化 | 磷酸转乙酰酶，参与乙酸生成，被敲除 |
| Escherichia coli | 中心碳代谢（乙酰-CoA 生成） | pflB | PflB | 催化 | 丙酮酸甲酸裂解酶，负责厌氧条件下乙酰-CoA 的生成，被敲除后丁醇产量几近消失 |
| Escherichia coli | 厌氧代谢调控 | fnr | Fnr | 调控 | 厌氧转录调控因子，抑制 PDHc 表达，被敲除以激活 PDHc 增加 NADH |
关键发现
- ['在大肠杆菌中表达梭菌 1-丁醇合成途径后，厌氧条件下产生
- 9 mg/L 1-丁醇。', '使用大肠杆菌内源 atoB 替代梭菌 thl，1-丁醇产量提高超过 3 倍。', '敲除 adhE、ldhA、frdBC 后，1-丁醇产量翻倍。', '同时敲除 pta 和 fnr 后，产量达到 373 mg/L，约为野生型水平的 3 倍。', '在 TB 培养基中添加甘油，产量达到 552 mg/L，是 M9 培养基（113 mg/L）的 5 倍。', 'E. coli 可耐受
- 5% (v/v) 的 1-丁醇。', 'AdhE2（Cac）对丁酰-CoA/乙酰-CoA 活性比值为
- 52，而 E. coli AdhE 为
- 25，故选择 adhE2。', '敲除 pflB 几乎完全抑制 1-丁醇生产，表明 Pfl 是厌氧条件下乙酰-CoA 的主要来源。']
研究结论
成功将梭菌 1-丁醇合成途径转移至大肠杆菌，并通过组合敲除竞争途径、替换关键酶和优化培养条件显著提高产量；最佳条件下 1-丁醇产量达 552 mg/L，且大肠杆菌可耐受 1.5% 丁醇，表明非天然、易操作的宿主可用于生物丁醇生产，为后续代谢工程优化奠定了基础。