Introducing glutathione biosynthetic capability into Lactococcus lactis subsp. cremoris NZ9000 improves the oxidative-stress resistance of the host
- 作者
- Rui-Yan Fu, Roger S. Bongers, Iris I. van Swam, Jian Chen, Douwe Molenaar, Michiel Kleerebezem, Jeroen Hugenholtz, Yin Li
- 单位
- The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education; School of Biotechnology, Southern Yangtze University; Wageningen Centre for Food Sciences and NIZO food research; Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences; Department of Microbiology and Alimentary Pharmacologic Centre, University College Cork; Laboratory of Tea Biochemistry & Biotechnology, Ministry of Agriculture and Ministry of Education; School of Tea and Food Science, Anhui Agricultural University
- 杂志
- Metabolic Engineering（2006）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2006.07.004
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
乳酸乳球菌 NZ9000 自身不能合成也不能摄取谷胱甘肽，对氧化胁迫的耐受性有限，需要提高其氧化胁迫抗性以增强工业发酵中菌株的鲁棒性。
研究策略
利用 NICE 表达系统将大肠杆菌的 gshA 和 gshB 基因导入乳酸乳球菌 NZ9000 及其 SOD 缺陷突变株 NZ4504，赋予其谷胱甘肽从头合成能力，从而增强宿主对 H2O2 和甲萘醌等氧化胁迫的耐受性。
核心内容
利用NICE表达系统，将大肠杆菌来源的谷胱甘肽合成关键酶编码基因gshA和gshB导入自身不能合成也无法摄取谷胱甘肽的乳酸乳球菌NZ9000及其SOD缺陷突变株NZ4504中，实现在宿主内重建完整的谷胱甘肽从头合成通路。经诱导后，NZ9000(pNZ3203)胞内谷胱甘肽含量随培养时间逐步积累，在生长7小时达到95.6 nmol/mg蛋白。该工程菌株的氧化胁迫耐受性得到显著提升，在150 mM过氧化氢处理15分钟后存活率较对照提高2.6倍，在20 mM甲萘醌处理60分钟后耐受性提高6.2倍。对于缺失超氧化物歧化酶的NZ4504菌株，引入谷胱甘肽合成能力促使其在50 mM过氧化氢处理45分钟后存活率提高10.8倍，并将氧化胁迫抗性恢复至接近野生型水平，同时恢复其有氧生长能力。外源添加5 mM半胱氨酸可使工程菌比生长速率从0.46 h⁻¹恢复至接近对照的0.73 h⁻¹。结果表明，谷胱甘肽依赖性还原系统在乳酸乳球菌氧化胁迫防御中发挥关键作用，通过代谢工程赋予宿主谷胱甘肽合成能力是提升工业发酵菌株鲁棒性的有效策略。
创新点
首次通过代谢工程手段在不能合成或摄取谷胱甘肽的乳酸乳球菌 NZ9000 中引入完整的谷胱甘肽合成途径，并证明其可显著提高宿主氧化胁迫抗性；构建了 SOD 缺陷突变株 NZ4504 并结合谷胱甘肽合成能力，进一步验证谷胱甘肽对宿主氧化耐受的修复作用。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Lactococcus lactis subsp. cremoris NZ9000 | 谷胱甘肽生物合成途径 | gshA | γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 | 催化 | 来自大肠杆菌，催化谷胱甘肽合成第一步 |
| Lactococcus lactis subsp. cremoris NZ9000 | 谷胱甘肽生物合成途径 | gshB | 谷胱甘肽合成酶 | 催化 | 来自大肠杆菌，催化谷胱甘肽合成第二步 |
| Lactococcus lactis subsp. cremoris NZ9000 | 氧化应激防御 | sodA | 锰超氧化物歧化酶 (Mn-SOD) | 催化 | 敲除该基因构建SOD缺陷突变株NZ4504 |
| Lactococcus lactis subsp. cremoris NZ4504 | 谷胱甘肽生物合成途径 | gshA | γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶 | 催化 | 在SOD缺陷株中表达，使NZ4504获得谷胱甘肽合成能力 |
| Lactococcus lactis subsp. cremoris NZ4504 | 谷胱甘肽生物合成途径 | gshB | 谷胱甘肽合成酶 | 催化 | 在SOD缺陷株中表达，与gshA共同合成谷胱甘肽 |
关键发现
- 在150 mM H2O2处理15 min条件下，产谷胱甘肽的NZ9000(pNZ3203)存活率比对照NZ9000(pNZ8148)高2.6倍
- 在20 mM甲萘醌处理40和60 min时，NZ9000(pNZ3203)的耐受性分别比对照高5.2和6.2倍。NZ4504(pNZ3203)在50 mM H2O2处理45 min时存活率比NZ4504(pNZ8148)高10.8倍，且恢复了SOD缺陷株的氧化胁迫抗性至野生型水平。NZ9000(pNZ3203)细胞内谷胱甘肽含量在生长3、5、7 h时分别为23.5、59.2、95.6 nmol/mg蛋白，与H2O2抗性呈正相关。NZ4504(pNZ3203)经4 h nisin诱导后谷胱甘肽含量为81.7 nmol/mg蛋白。外源添加5 mM半胱氨酸可使NZ9000(pNZ3203)的比生长速率从0.46 h^-1恢复至接近对照的0.73 h^-1。
研究结论
通过代谢工程将谷胱甘肽合成能力引入不能合成或摄取谷胱甘肽的乳酸乳球菌NZ9000，可显著提高宿主对H2O2和超氧化物胁迫的抗性；在SOD缺陷菌株中，谷胱甘肽可部分恢复其有氧生长能力并将氧化胁迫抗性恢复至野生型水平，说明谷胱甘肽依赖性还原系统在乳酸乳球菌氧化胁迫防御中发挥重要作用，为工业发酵中提高菌株鲁棒性提供了新途径。