Transcriptional response of the terpenoid indole alkaloid pathway to the overexpression of ORCA3 along with jasmonic acid elicitation of Catharanthus roseus hairy roots over time
- 作者
- Christie A.M. Peebles, Erik H. Hughes, Jacqueline V. Shanks, Ka-Yiu San
- 单位
- Department of Bioengineering, Rice University; Department of Chemical and Biological Engineering, Rice University; Department of Chemical and Biological Engineering, Iowa State University
- 杂志
- Metabolic Engineering（2009）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2008.09.002
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
研究长春花毛状根中转录因子ORCA3过表达及其与茉莉酸（JA）协同处理对萜类吲哚生物碱（TIA）途径的转录响应，并揭示ORCA3过表达未能显著提高TIA积累的调控机制。
研究策略
采用糖皮质激素诱导启动子系统在长春花毛状根中可控过表达ORCA3，同时外源饲喂茉莉酸，利用Q-RT-PCR和HPLC追踪72小时内TIA途径基因和调控因子的mRNA水平及代谢物浓度变化。
核心内容
该研究利用糖皮质激素诱导启动子系统，在长春花毛状根中可控过表达转录因子ORCA3，并结合茉莉酸外源饲喂，通过Q-RT-PCR和HPLC在72小时内追踪萜类吲哚生物碱途径多个基因及代谢物的动态变化。结果显示，同时诱导ORCA3和JA处理时ORCA3转录本增加170倍，单独过表达增加89倍。然而，JA单独处理使TIA途径多数基因转录本和蛇根碱、长春质碱等代谢物积累增加最为显著，转录峰值出现在12至24小时。ORCA3过表达虽提高了ASα、DXS、STR等转录本，但TDC、G10H保持不变，SGD转录本下降，且ZCT1和ZCT2等转录抑制因子随ORCA3上升而同步增加，喂食洛加宁和色氨酸前体也未能提升代谢物水平。研究表明，ORCA3过表达因负反馈抑制和SGD下调而未能有效增加TIA产量，JA诱导更为高效，且TIA途径调控存在组织特异性，需同时抑制负调控因子才能提升通量。
创新点
首次在分化的毛状根组织中比较ORCA3过表达与JA诱导的时程转录响应；发现ORCA3过表达诱导ZCT1/ZCT2等转录抑制因子的补偿性上升，解释了ORCA3高表达未相应增加下游基因转录的现象；揭示了细胞悬浮培养与毛状根中ORCA3调控结果的差异。
研究对象（16）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus hairy roots (EHIORCA3-4-1) | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成途径 | ORCA3 | AP2结构域转录因子ORCA3 | 调控 | 茉莉酸响应转录激活因子，受糖皮质激素诱导启动子控制 |
| Catharanthus roseus hairy roots (EHIORCA3-4-1) | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成途径 | ORCA2 | AP2结构域转录因子ORCA2 | 调控 | JA诱导的转录激活因子，JA处理后转录本增加14倍 |
| Catharanthus roseus hairy roots (EHIORCA3-4-1) | TIA途径负调控 | ZCT1 | 锌指结合蛋白ZCT1 | 调控 | 转录抑制因子，结合STR和TDC启动子抑制表达，响应ORCA3上调 |
| Catharanthus roseus hairy roots (EHIORCA3-4-1) | TIA途径负调控 | ZCT2 | 锌指结合蛋白ZCT2 | 调控 | 转录抑制因子，与ZCT1类似，表达随ORCA3上升而增加 |
| Catharanthus roseus hairy roots (EHIORCA3-4-1) | TIA途径负调控 | ZCT3 | 锌指结合蛋白ZCT3 | 调控 | 转录抑制因子，但响应幅度小于ZCT1/ZCT2 |
| Catharanthus roseus hairy roots (EHIORCA3-4-1) | TIA途径负调控 | GBF1 (CrGBF1) | G-box结合因子1 | 调控 | 抑制STR表达，本研究中未观察到显著响应 |
| Catharanthus roseus hairy roots (EHIORCA3-4-1) | TIA途径负调控 | GBF2 (CrGBF2) | G-box结合因子2 | 调控 | 抑制STR表达，本研究中未观察到显著响应 |
| Catharanthus roseus hairy roots (EHIORCA3-4-1) | 吲哚途径（色氨酸生物合成） | ASα | 邻氨基苯甲酸合酶α亚基 | 催化 | 催化色氨酸生物合成第一步，JA处理后转录本显著增加 |
| Catharanthus roseus hairy roots (EHIORCA3-4-1) | 吲哚生物碱途径 | TDC | 色氨酸脱羧酶 | 催化 | 催化色氨酸转化为色胺，JA诱导转录，ORCA3过表达对其无影响 |
| Catharanthus roseus hairy roots (EHIORCA3-4-1) | 萜类（MEP）途径 | DXS | 1-脱氧-D-木酮糖5-磷酸合酶 | 催化 | MEP途径限速酶，JA处理后转录本峰值出现在6-12小时 |
| Catharanthus roseus hairy roots (EHIORCA3-4-1) | 萜类（MEP）途径 | G10H | 香叶醇10-羟化酶 | 催化 | 单萜类骨架羟化，JA诱导转录，ORCA3过表达不影响其表达 |
| Catharanthus roseus hairy roots (EHIORCA3-4-1) | 细胞色素P450系统 | CPR | NADPH-细胞色素P450还原酶 | 能量供给 | 为P450酶（如G10H、SLS）提供电子，本研究中表达无显著变化 |
| Catharanthus roseus hairy roots (EHIORCA3-4-1) | 单萜途径 | SLS | 裂环马钱苷合酶 | 催化 | 催化马钱苷裂环生成裂环马钱苷，JA和ORCA3过表达均增加其转录 |
| Catharanthus roseus hairy roots (EHIORCA3-4-1) | 萜类吲哚生物碱（TIA）途径 | STR | 异胡豆苷合酶 | 催化 | 催化色胺与裂环马钱苷缩合，ORCA3过表达和JA处理均上调 |
| Catharanthus roseus hairy roots (EHIORCA3-4-1) | 萜类吲哚生物碱（TIA）途径 | SGD | 异胡豆苷β-D-葡萄糖苷酶 | 催化 | 催化异胡豆苷水解，JA处理增加其转录，ORCA3过表达反而降低 |
| Catharanthus roseus hairy roots (EHIORCA3-4-1) | 参考基因 | rsp9 | 40S核糖体蛋白S9 | 调控 | 作为Q-RT-PCR的内参基因 |
关键发现
- 同时诱导ORCA3表达和JA处理时，ORCA3转录本增加170倍
- 仅ORCA3过表达增加89倍
- 仅JA处理增加5倍。JA单独处理使TIA途径基因（ASα、TDC、DXS、G10H、STR等）转录本和代谢物（蛇根碱、长春质碱、洛柯宁碱等）增加最多，转录峰值出现在12-24小时。ORCA3过表达导致ASα、DXS、STR、SLS和ZCT1/ZCT2转录本增加，而TDC、G10H、CPR、GBF和ORCA2保持不变，SGD转录本下降。JA处理使ORCA2转录本增加14倍。ZCT1和ZCT2转录本的上升与ORCA3转录本上升同步。ORCA3过表达及ORCA3过表达+JA处理均导致它波宁、洛柯宁碱和荷哈默里辛浓度显著下降（p<0.05）。喂食洛加宁和色氨酸前体未能提高ORCA3过表达体系的TIA代谢物水平。
研究结论
JA单独处理比ORCA3过表达更有效提高TIA途径转录本和代谢物积累。ORCA3过表达未能大幅增加TIA产量，部分原因是SGD转录本下降以及ZCT等转录抑制因子的负反馈补偿。研究提示TIA途径调控存在组织特异性机制，并可能涉及除ORCA3以外的其他正调控因子，需要在过表达正调控因子的同时抑制负调控因子才能有效增加TIA通量。