Replacing Escherichia coli NAD-dependent glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) with a NADP-dependent enzyme from Clostridium acetobutylicum facilitates NADPH dependent pathways
- 作者
- Irene Martínez, Jiangfeng Zhu, Henry Lin, George N. Bennett, Ka-Yiu San
- 单位
- Department of Bioengineering, Rice University, Houston, TX, USA; Department of Biochemistry and Cell Biology, Rice University, Houston, TX, USA
- 杂志
- Metabolic Engineering（2008）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2008.09.001
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
大肠杆菌胞内NADPH供给不足，限制了依赖NADPH的工业化合物（如番茄红素、ε-己内酯）的合成产量。
研究策略
通过敲除内源NAD依赖的gapA基因，并异源表达丙酮丁醇梭菌的NADP依赖的gapC基因，使糖酵解步骤产生NADPH而非NADH，从而增加NADPH的胞内供给。
核心内容
本研究针对大肠杆菌胞内NADPH供给不足限制依赖NADPH工业化合物合成的问题，提出了一种辅因子工程策略：敲除内源NAD依赖的gapA基因，并异源表达来自丙酮丁醇梭菌的NADP依赖的gapC基因，使糖酵解步骤直接产生NADPH而非NADH。该策略在MG1655和BL21(DE3)两种遗传背景中均成功实现。改造后菌株最大比生长速率从0.48 h⁻¹降至0.38 h⁻¹，糖酵解通量增加约35%，氧化性磷酸戊糖途径通量降至对照的20%以下。在应用验证中，番茄红素产量达到对照的2.5倍；ε-己内酯产量从1.72 mol/mol葡萄糖提高至2.97 mol/mol葡萄糖，NADPH供给增加72.7%。该工作首次在不引起显著生长缺陷的前提下实现糖酵解NADPH替代NADH生产，为依赖NADPH的工业产物合成提供了一种普适性的辅因子供给优化策略，对萜类、内酯等还原性化合物的微生物合成具有重要参考价值。
创新点
首次在大肠杆菌中以NADP依赖的GAPDH替换NAD依赖的GAPDH，在不引起生长缺陷的前提下提高NADPH产量；该策略在两种不同遗传背景的E. coli（MG1655和BL21(DE3)）中均有效。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli MG1655（MBS100M） | 糖酵解 | gapA | GAPDH（NAD依赖） | 催化 | 内源NAD依赖GAPDH被敲除 |
| Escherichia coli MG1655（MBS100M） | 糖酵解 | gapC | GAPDH（NADP依赖） | 催化 | 来自Clostridium acetobutylicum，产生NADPH |
| Escherichia coli BL21(DE3)（MBS100B） | 糖酵解 | gapC | GAPDH（NADP依赖） | 催化 | 用于ε-己内酯生产的菌株 |
| Escherichia coli MG1655 | 番茄红素合成途径（非甲羟戊酸途径） | crtE, crtI, crtB | CrtE, CrtI, CrtB | 催化 | 来自Erwinia herbicola，异源表达合成番茄红素 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | Baeyer-Villiger氧化途径 | chmo | 环己酮单加氧酶（CHMO） | 催化 | 来自Acinetobacter sp. NCIB 9871，催化环己酮生成ε-己内酯 |
关键发现
- 将NAD依赖的GAPDH替换为NADP依赖的GAPDH后：①MBS100M菌株最大比生长速率从0.48 h⁻¹降至0.38 h⁻¹
- 糖酵解通量增加约35%，氧化性磷酸戊糖途径通量降至对照的20%以下
- 番茄红素产量（浓度）为对照的2.5倍，比产量为2.4倍
- ε-己内酯产量从1.72 mol/mol葡萄糖提高至2.97 mol/mol葡萄糖，NADPH供给增加72.7%
- 产生2 mol NADPH/mol葡萄糖代替2 mol NADH。
研究结论
用来自C. acetobutylicum的NADP依赖型GAPDH替代E. coli内源NAD依赖型GAPDH，能够在两种E. coli宿主中有效提高NADPH可用性，从而显著提升番茄红素和ε-己内酯等NADPH依赖产物的产量，是一种普适的辅因子工程策略。