高级醇 · 代谢工程文献库

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Enhancing sesquiterpene production in Saccharomyces cerevisiae through in silico driven metabolic engineering

作者
Mohammad A. Asadollahi, Jérôme Maury, Kiran Raosaheb Patil, Michel Schalk, Anthony Clark, Jens Nielsen
单位
Center for Microbial Biotechnology (CMB), Department of Systems Biology, Technical University of Denmark (DTU); Biotechnology Group, Faculty of Advanced Sciences and Technologies, University of Isfahan; Firmenich SA, Corporate R&D Division; Firmenich Inc., Corporate R&D Division
杂志
Metabolic Engineering（2009）
DOI
10.1016/j.ymben.2009.07.001
所属领域
代谢工程
关键词
CubebolFlux balance analysisGlutamate dehydrogenaseIn silico metabolic engineeringIsoprenoidMinimization of metabolic adjustmentsNADPH availabilitySaccharomyces cerevisiaeSesquiterpene
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解决的核心问题

如何通过基因组规模代谢模型识别酵母中提高倍半萜（尤其cubebol）产量的新靶基因，而不局限于甲羟戊酸途径直接相关基因。

研究策略

利用酿酒酵母基因组规模代谢模型（1175个反应、584个代谢物），加入FPP到倍半萜的反应，采用OptGene框架和MOMA目标函数进行基因敲除模拟，预测最佳敲除靶点GDH1；随后通过实验验证GDH1敲除及GDH2过表达对生长和cubebol产量的影响。

研究路线图

100%
问题：如何识别提高倍半萜（cubebol）产量的新靶点？
策略1：构建基因组规模代谢模型（1175反应，584代谢物）
策略2：OptGene+MOMA模拟基因敲除，预测最佳靶点GDH1
关键改造1：敲除GDH1（增加胞质NADPH）
关键改造2：GDH2过表达（恢复生长）
关键改造3：tHMG1过表达（增强MVA通量）
结果：cubebol产量从3.2增至8.4 mg/L，总倍半萜30.1 mg/L
结论：计算模拟（MOMA/OptGene）成功发现非经典靶点GDH1，其敲除通过NADPH增效提高倍半萜产量
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核心内容

该研究利用酿酒酵母基因组规模代谢模型，结合OptGene框架与MOMA目标函数进行基因敲除模拟，旨在识别提高倍半萜（cubebol）产量的非甲羟戊酸途径新靶点。通过在全基因组范围内预测，GDH1被确定为最佳敲除靶点。实验验证显示，敲除GDH1使cubebol终产量增加约85%，从3.2 mg/L升至5.9 mg/L，但最大比生长速率由0.20 h⁻¹显著降至0.07 h⁻¹；过表达GDH2可将生长速率恢复至0.13 h⁻¹，但未进一步提升产物产量。在此基础上，过表达tHMG1使cubebol产量进一步提高至8.4 mg/L，总倍半萜最高达30.1 mg/L，cubebol对生物量的最高产率为0.83 mg/g DW。研究表明，通过修饰氨同化途径（GDH1敲除、GDH2过表达）可提高胞质NADPH可用性，间接增强甲羟戊酸途径与倍半萜合成，但伴随生长代价。该工作首次在酵母中应用MOMA/OptGene进行倍半萜生产全基因组靶点预测，证实基因组规模模型结合计算策略能有效发现传统途径之外的代谢工程靶点。

创新点

首次在酵母中应用MOMA/OptGene进行倍半萜生产的全基因组靶点预测；提出通过修饰氨同化途径（GDH1敲除、GDH2过表达）提高胞质NADPH可用性，间接增强甲羟戊酸途径和倍半萜合成。

研究对象（5）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae 氨同化/谷氨酸合成途径 GDH1 NADPH依赖性谷氨酸脱氢酶 催化 敲除后增加胞质NADPH可用性，提高倍半萜产量
酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae 氨同化/谷氨酸合成途径 GDH2 NADH依赖性谷氨酸脱氢酶 催化 过表达以弥补GDH1缺失导致的氨利用缺陷并恢复生长
酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae 甲羟戊酸途径 tHMG1 截短的HMG-CoA还原酶（催化域） 催化 过表达进一步提高cubebol产量
酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae 倍半萜生物合成 GFTPsc cubebol合酶（来自葡萄柚 Citrus paradisi） 催化 异源表达，将FPP转化为cubebol
酿酒酵母 Saccharomyces cerevisiae 甲羟戊酸途径 ERG9 法尼基焦磷酸合成酶 催化 文中提及但未操纵，作为经典靶点比较

关键发现

  1. GDH1敲除使cubebol终产量增加约85%（从3.2 mg/L增至5.9 mg/L），但最大比生长速率显著下降（从0.20 h-1降至0.07 h-1）
  2. 过表达GDH2使生长速率恢复至0.13 h-1但cubebol产量无进一步提升
  3. tHMG1过表达进一步将cubebol产量提高至8.4 mg/L
  4. 总倍半萜最高达30.1 mg/L（YIP-MC-11）
  5. cubebol对生物量最高产率为0.83 mg/g DW，对半乳糖最高产率为0.28 mg/g。

研究结论

通过计算模拟指导的代谢工程成功识别了非甲羟戊酸途径的新靶点GDH1，其敲除通过增加NADPH可用性提高倍半萜产量，但伴随生长缺陷；结合GDH2过表达可恢复部分生长。研究表明基因组规模模型与MOMA策略可有效发现新的代谢工程靶点。