Rational design and construction of an efficient E. coli for production of diapolypocendoic acid
- 作者
- Pornkamol Unrean, Cong T. Trinh, Friedrich Srien
- 单位
- Department of Chemical Engineering and Materials Science, and BioTechnology Institute, University of Minnesota, 240 Gortner Laboratory, 1479 Gortner Ave, St. Paul, MN 55108, USA
- 杂志
- Metabolic Engineering（2009）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2009.11.002
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何理性设计大肠杆菌菌株以提高类胡萝卜素（DPL和DPA）的产量，避免传统非系统遗传改造的盲目性和低效率。
研究策略
应用元素模式分析（EMA）对类胡萝卜素生产重组大肠杆菌的代谢网络进行分解，识别能够消除低效途径的多基因敲除组合，并通过实验构建验证。
核心内容
本研究将元素模式分析（EMA）拓展应用于次级代谢产物生产菌株的理性设计，以大肠杆菌MG1655为底盘，目标产物为类胡萝卜素diapolycopendioic acid（DPA）及其相关化合物。作者通过EMA分解类胡萝卜素生产菌株的代谢网络，识别出8个可敲除的低效途径基因（涵盖乳酸、延胡索酸、乙醇等发酵途径及糖酵解、磷酸戊糖和回补途径），逐一敲除后将代谢网络简化为仅5个全部指向类胡萝卜素合成的元素模式，构建出突变株CRT028/pACMNox。在好氧批式生物反应器中，该菌株的类胡萝卜素产量达0.17±0.04 mg/g葡萄糖，为野生型的4.25倍；产物浓度从0.19 mg/L提升至0.83 mg/L，比生产速率提高一个数量级至0.10 mg/g细胞干重·h，尽管生长速率降低23%。实验产量与EMA预测基本吻合，且该突变株还能提高番茄红素、四脱氢番茄红素等多种类胡萝卜素的产量。该工作证明EMA是设计次级代谢产物生产菌株的有效理性工具，所得菌株可作为多种类胡萝卜素生产的通用平台。
创新点
将元素模式分析（EMA）拓展应用于次级代谢产物（类胡萝卜素）生产的理性菌株设计；通过顺序敲除8个基因，将代谢网络简化为仅5个全部指向类胡萝卜素合成的元素模式，实现产量和速率的显著提升。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli MG1655 | — | — | — | — | 宿主菌株 |
| Escherichia coli MG1655 | 发酵 | ldhA | 乳酸脱氢酶 | 催化 | 敲除靶点，消除乳酸合成 |
| Escherichia coli MG1655 | 发酵 | frdA | 延胡索酸还原酶 | 催化 | 敲除靶点，消除琥珀酸合成 |
| Escherichia coli MG1655 | 发酵 | poxB | 丙酮酸氧化酶 | 催化 | 敲除靶点，消除乙酸合成 |
| Escherichia coli MG1655 | 发酵 | pta | 磷酸转乙酰酶 | 催化 | 敲除靶点，消除乙酸合成 |
| Escherichia coli MG1655 | 发酵 | adhE | 乙醇脱氢酶 | 催化 | 敲除靶点，消除乙醇合成 |
| Escherichia coli MG1655 | 糖酵解 | pykF | 丙酮酸激酶 | 催化 | 敲除靶点，增加类胡萝卜素前体供应 |
| Escherichia coli MG1655 | 磷酸戊糖途径 | zwf | 葡萄糖-6-磷酸-1-脱氢酶 | 催化 | 敲除靶点，减少碳损失 |
| Escherichia coli MG1655 | 回补途径 | maeB | 苹果酸酶 | 催化 | 敲除靶点，防止前体流向回补途径 |
| Escherichia coli MG1655 | 类胡萝卜素生物合成 | crtM | 4,4'-diapophytoene synthase | 催化 | 质粒pACMNox编码 |
| Escherichia coli MG1655 | 类胡萝卜素生物合成 | crtN | 4,4'-diapophytoene desaturase | 催化 | 质粒pACMNox编码 |
| Escherichia coli MG1655 | 类胡萝卜素生物合成 | crtOx | 类胡萝卜素氧化酶 | 催化 | 质粒pACMNox编码 |
关键发现
- ['在好氧批式生物反应器中，突变株CRT028/pACMNox的类胡萝卜素产量为0.17±0.04 mg/g葡萄糖，是野生型MG1655/pACMNox（0.04±0.00 mg/g葡萄糖）的4.25倍。', '突变株类胡萝卜素浓度从0.19±0.02 mg/L提高到0.83±0.20 mg/L，比生产速率从0.01±0.00提高到0.10±0.02 mg/g细胞干重·h。', '突变株生长速率降低23%（0.13±0.01 h-1 vs 0.17±0.02 h-1）。', 'EMA预测最大类胡萝卜素产率为0.83碳摩尔/碳摩尔葡萄糖
- 突变株仅剩余5个元素模式，最低预测产率为0.41 mg/g葡萄糖，实验值0.17 mg/g葡萄糖与假设每摩尔DPA需8摩尔NADP时的预测值0.15 mg/g葡萄糖一致。', '突变株还能提高其他类胡萝卜素（diapolypocene、tetradehydrolycopene、tetradehydrolycopendiol、lycopene）的产量。']
研究结论
元素模式分析（EMA）是理性设计次级代谢产物生产菌株的有效工具，通过敲除8个基因构建的CRT028突变株显著提高了类胡萝卜素产量，且该菌株可作为多种类胡萝卜素生产的平台。