Metabolic engineering of geranic acid in maize to achieve fungal resistance is compromised by novel glycosylation patterns
- 作者
- Ting Yang, Geert Stoopen, Nasser Yalpani, Jacques Vervoort, Ric de Vos, Alessandra Voster, Francel W.A. Verstappen, Harro J. Bouwmeester, Maarten A. Jongsma
- 单位
- Plant Research International, Wageningen UR; Pioneer Hi-Bred International; Laboratory of Biochemistry, Wageningen UR; Laboratory of Plant Physiology, Wageningen UR; Centre for Biosystems Genomics
- 杂志
- Metabolic Engineering（2011）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2011.01.011
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在玉米中通过代谢工程积累香叶酸以提高真菌抗性，但香叶酸被内源糖基化/丙二酰化途径转化为无活性的糖苷衍生物，导致目标化合物无法以游离形式有效积累，抗性未能提高。
研究策略
先体外测试15种单萜和倍半萜对玉米病原真菌（Colletotrichum graminicola和Fusarium graminearum）的抑制活性，确定香叶酸为最强抗真菌剂；随后从Lippia dulcis克隆香叶醇合酶基因LdGES并在玉米中过表达，结合非靶向GC-MS和LC-MS代谢组学分析挥发性和非挥发性代谢物变化，并开展真菌接种抗性评价。
核心内容
本研究在玉米中过表达来自Lippia dulcis的香叶醇合酶基因LdGES，旨在通过积累香叶酸提高对禾谷炭疽菌和禾谷镰刀菌的抗性。体外试验显示香叶酸抑菌活性最强，对两种病原菌的最低抑菌浓度均低于7.8 μg/mL。然而，转基因玉米叶片中未检测到游离香叶醇或香叶酸，代谢组学分析发现香叶醇被内源氧化为香叶酸后，迅速经糖基化和丙二酰化修饰，主要转化为新化合物geranoyl-6-O-malonyl-β-D-glucopyranoside，平均浓度约17 μg/g鲜重，该化合物在对照中未检出。切离叶片中乙酸香叶酯释放量较对照提高5.05倍，且与LdGES表达水平正相关。但真菌接种试验显示转基因株与对照的病变面积无显著差异，抗性未获改善，而植株农艺性状未受影响。结果表明，玉米内源糖基化和丙二酰化支路是工程化萜类产物积累的关键代谢屏障，未来需抑制该支路或引入可释放糖苷配基的糖苷酶以实现有效抗性改良。
创新点
利用非靶向LC-MS代谢组学结合NMR鉴定了一个植物界新化合物geranoyl-6-O-malonyl-β-D-glucopyranoside；揭示了玉米内源糖基化和丙二酰化支路途径对工程化萜类产物积累的代谢屏障作用。
研究对象（1）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Zea mays (玉米) | 萜类代谢 | LdGES | 香叶醇合酶 (geraniol synthase from Lippia dulcis) | 催化 | 催化geranyl diphosphate生成geraniol；编码区置于玉米泛素启动子下过表达，导致geraniol被内源代谢为geranic acid及其糖苷衍生物 |
关键发现
- ['体外抗真菌试验中，香叶酸对C. graminicola和F. graminearum的MIC均<7.8 μg/mL（约46 μM），MCIC分别为7.8和31.3 μg/mL，为15种萜类中最强抑制剂。', '转基因玉米叶片中未检测到游离香叶醇和香叶酸，但显著上调了7种香叶醇衍生物，包括2种香叶酸糖苷、1种香叶醇二己糖和4种羟基香叶酸己糖。', '丰度最高的新化合物为geranoyl-6-O-malonyl-β-D-glucopyranoside，平均浓度约17 μg/g鲜重（约45 μM），对照中该化合物低于检出限。', '切离叶片中乙酸香叶酯释放量比对照高5.05倍，且与LdGES表达水平呈正相关（R²=0.88）。', '真菌接种试验中，转基因植株与对照组的病变面积无显著差异（C. graminicola:
- 670 vs
- 708 cm²；F. graminearum:
- 778 vs
- 589 cm²），抗性未提高。', '转基因植株的表型（株高、叶片数、叶绿素含量、籽粒重）与对照无显著差异。']
研究结论
香叶酸在体外具有很强的抗真菌活性，但在玉米中过表达香叶醇合酶后，生成的香叶醇经内源氧化形成香叶酸，并迅速被糖基化和丙二酰化修饰储存（主要生成geranoyl-6-O-malonyl-β-D-glucopyranoside），导致活性香叶酸无法积累，因此真菌抗性未得到改善。要实现目标，需要抑制支路糖基化/丙二酰化途径，或引入可在真菌侵染时释放糖苷配基的糖苷酶。