Targeted proteomics for metabolic pathway optimization: Application to terpene production
- 作者
- Alyssa M. Redding-Johanson, Tanveer S. Batth, Rossana Chan, Rachel Krupa, Heather L. Szmidt, Paul D. Adams, Jay D. Keasling, Taek Soon Lee, Aindrila Mukhopadhyay, Christopher J. Petzold
- 单位
- Lawrence Berkeley National Laboratory; Physical Biosciences Division; Joint BioEnergy Institute
- 杂志
- Metabolic Engineering（2011）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2010.12.005
- 所属领域
- 代谢工程 / 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
在大肠杆菌生产amorpha-4,11-diene的甲羟戊酸途径中，如何识别和解除限制产量的瓶颈蛋白（尤其是MK和PMK表达量低）以实现高产。
研究策略
利用基于SRM质谱的靶向蛋白质组学技术定量检测途径中各蛋白水平，结合mRNA分析和产物滴度，定位瓶颈；随后通过密码子优化和更换强启动子来提高瓶颈蛋白表达，并在蛋白、转录本和产物水平验证优化效果。
核心内容
本研究将基于SRM质谱的靶向蛋白质组学系统应用于大肠杆菌产amorpha-4,11-diene的甲羟戊酸途径优化，直接定量了途径中AtoB、HMGS、HMGR、MK、PMK、PMD等各蛋白水平，以期精准识别限速瓶颈。定量结果显示，在2p菌株中MK和PMK蛋白几乎检测不到，而RT-PCR表明其转录水平与PMD相当，提示瓶颈源于翻译或蛋白稳定性问题。针对该瓶颈，作者对MK和PMK基因进行密码子优化并更换为trc强启动子，使PMK蛋白提高2.7倍，转录提高10倍、蛋白提高7.5倍；MK转录提高7.5倍但蛋白仅提高1.8倍，反映出转录-翻译关系的复杂性。改造后amorpha-4,11-diene终产量较2p菌株提高330%以上，达到>500 mg/L。该工作表明靶向蛋白质组学能够揭示转录与代谢物数据无法捕捉的蛋白水平瓶颈，是代谢途径优化中不可或缺的定量工具。
创新点
将SRM靶向蛋白质组学首次系统应用于代谢途径优化，实现对多基因途径各蛋白的直接定量；揭示了转录水平与蛋白水平之间的复杂关系，并成功用于指导途径瓶颈的精准改造。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸途径 (mevalonate pathway) | atoB | AtoB (acetoacetyl-CoA synthase) | 催化 | 来自大肠杆菌，催化乙酰辅酶A转化为乙酰乙酰辅酶A，pMevT或pBbA5c-MevT-MBIS质粒表达 |
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸途径 (mevalonate pathway) | HMGS | HMGS (HMG-CoA synthase) | 催化 | 来自酿酒酵母，催化乙酰乙酰辅酶A与乙酰辅酶A缩合生成HMG-CoA |
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸途径 (mevalonate pathway) | HMGR | HMGR (HMG-CoA reductase) | 催化 | 来自酿酒酵母，N端截短以去除调控结构域并提高可溶性，催化HMG-CoA还原为甲羟戊酸 |
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸途径 (mevalonate pathway) | MK | MK (mevalonate kinase) | 催化 | 来自酿酒酵母，催化甲羟戊酸磷酸化为5-磷酸甲羟戊酸；在3p和2p菌株中表达量极低，为瓶颈蛋白；密码子优化和强启动子后表达显著提高 |
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸途径 (mevalonate pathway) | PMK | PMK (phosphomevalonate kinase) | 催化 | 来自酿酒酵母，催化5-磷酸甲羟戊酸磷酸化为5-焦磷酸甲羟戊酸；在3p和2p菌株中表达量极低，为瓶颈蛋白；密码子优化和强启动子后表达显著提高 |
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸途径 (mevalonate pathway) | PMD | PMD (phosphomevalonate decarboxylase) | 催化 | 来自酿酒酵母，催化5-焦磷酸甲羟戊酸脱羧生成IPP |
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸途径 (mevalonate pathway) | idi | Idi (isopentenyl diphosphate isomerase) | 催化 | 来自大肠杆菌，催化IPP异构化为DMAPP |
| Escherichia coli DH1 | 甲羟戊酸途径 (mevalonate pathway) | ispA | IspA (farnesyl diphosphate synthase) | 催化 | 来自大肠杆菌，催化IPP和DMAPP缩合生成FPP |
| Escherichia coli DH1 | amorpha-4,11-diene合成途径 | ADS | ADS (amorpha-4,11-diene synthase) | 催化 | 来自青蒿 (Artemisia annua)，催化FPP环化生成amorpha-4,11-diene，由pADS质粒表达 |
关键发现
- 通过SRM定量发现，与3p菌株相比，2p菌株中AtoB、HMGS和HMGR蛋白水平至少高6倍，但MK和PMK蛋白几乎检测不到，被鉴定为瓶颈。RT-PCR显示MK和PMK转录水平与PMD相当，但蛋白极低，表明存在翻译或降解问题。将MK和PMK基因密码子优化并加上trc强启动子后，MK和PMK蛋白水平显著提高，amorpha-4,11-diene终产量较2p菌株提高330%以上，达到>500 mg/L。具体地，密码子优化使PMK蛋白提高2.7倍
- 加入trc启动子后PMK转录提高10倍、蛋白提高7.5倍，而MK转录提高7.5倍、蛋白仅提高1.8倍，反映了转录-翻译的复杂性。另外，RFP实验显示p15A复制子蛋白表达量为pSC101的2.7倍，ColE1为pSC101的7.5倍。
研究结论
通过SRM靶向蛋白质组学成功鉴定了amorpha-4,11-diene合成途径中的瓶颈蛋白MK和PMK，并通过密码子优化与强启动子表达大幅提升了蛋白水平和产物滴度（>500 mg/L，较原菌株提高3倍以上）。研究表明蛋白质定量是代谢途径优化中不可替代的关键工具，能够提供转录和代谢物测量无法揭示的信息。