Synergy as design principle for metabolic engineering of 1-propanol production in Escherichia coli
- 作者
- Claire R. Shen, James C. Liao
- 单位
- Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of California, Los Angeles; Institute for Genomics and Proteomics, University of California, Los Angeles
- 杂志
- Metabolic Engineering（2013）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2013.01.008
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
单一代谢途径在特定宿主和培养条件下存在还原力、ATP需求、碳效率等方面的局限，导致1-丙醇产量和产率不高；需要设计途径协同来弥补各自不足。
研究策略
以大肠杆菌1-丙醇生产为例，结合天然苏氨酸途径与异源柠苹酸途径，通过基于化学计量平衡的最大理论产量计算预测两途径在不同通量比下的协同效应，并通过基因敲除、质粒过表达等实验验证协同对产量和产率的提升。
核心内容
该研究提出将“途径协同”作为代谢工程的设计原则，并以大肠杆菌生产1-丙醇为模型进行了验证。研究者将天然苏氨酸途径与异源柠苹酸途径耦合，二者在还原力、ATP需求和TCA循环依赖性上互补。通过化学计量模型计算理论最大产量，预测了不同通量比下的协同效应，随后通过基因敲除与质粒过表达进行实验验证。结果表明，双途径菌株在微好氧条件下1-丙醇产量达0.15 g/g葡萄糖，产率为0.12 g/L/h，最高滴度8 g/L，而单独途径的产量分别为0.09和0.11 g/g，产率仅约0.04 g/L/h。理论计算显示，有氧条件下两途径通量比为1:1时理论产量最高可达1.33 mol/mol葡萄糖，而单一途径仅为1 mol/mol。敲除TCA循环关键基因gltA后，苏氨酸途径产量完全丧失，但双途径仅下降30%，体现了其对TCA循环依赖性的互补。敲除pta和poxB虽将乙酸降至1 g/L以下，但1-丙醇产量下降40%。通过培养基置换可实现11天连续生产，平均产率2–3 g/L/day。该工作表明途径协同可显著提升产量、产率与滴度，可作为代谢工程中改善化学品生产效率的通用设计策略。
创新点
提出将途径协同（synergy）作为代谢工程的设计原则；通过模型指导识别互补的辅因子需求和驱动力，双途径耦合使1-丙醇产量提高30-50%，产率提高约3倍。
研究对象（17）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 苏氨酸生物合成途径 | thrA^Br | 天冬氨酸激酶（反馈抗性突变体） | 催化 | 解除反馈抑制，增强苏氨酸合成 |
| Escherichia coli | 苏氨酸生物合成途径 | thrB | 高丝氨酸激酶 | 催化 | 苏氨酸合成步骤，也是基因敲除靶点之一 |
| Escherichia coli | 苏氨酸生物合成途径 | thrC | 苏氨酸合成酶 | 催化 | 苏氨酸合成步骤 |
| Escherichia coli | 苏氨酸生物合成途径 | ilvA | 苏氨酸脱氨酶 | 催化 | 催化苏氨酸生成2-酮丁酸 |
| Escherichia coli | 柠苹酸途径 | cimA (cimA2A) | 柠苹酸合酶（Methanococcus jannaschii来源） | 催化 | 经定向进化获得，催化乙酰辅酶A和丙酮酸缩合生成柠苹酸 |
| Escherichia coli | 柠苹酸途径 | leuABCD | LeuA/LeuB/LeuC/LeuD 酶复合物 | 催化 | 内源亮氨酸生物合成酶，利用其底物杂泛性将柠苹酸转化为2-酮丁酸 |
| Escherichia coli | 2-酮丁酸下游合成1-丙醇 | kivd | 酮异戊酸脱羧酶（Lactococcus lactis来源） | 催化 | 催化2-酮丁酸脱羧生成丙醛 |
| Escherichia coli | 2-酮丁酸下游合成1-丙醇 | ADH2 | 醇脱氢酶2（Saccharomyces cerevisiae来源） | 催化 | NADH依赖，催化丙醛还原为1-丙醇 |
| Escherichia coli | 2-酮丁酸下游合成1-丙醇 | yqhD | 醇脱氢酶YqhD（E. coli内源） | 催化 | NADPH依赖，替代ADH2用于1-丙醇合成 |
| Escherichia coli | TCA循环 | gltA | 柠檬酸合酶 | 催化 | TCA循环关键酶，删除后苏氨酸途径1-丙醇生产完全丧失；双途径中影响较小 |
| Escherichia coli | 乙酸合成途径 | pta | 磷酸转乙酰酶 | 催化 | 删除可减少乙酸生成，但ATP供应受损，1-丙醇产量下降 |
| Escherichia coli | 乙酸合成途径 | poxB | 丙酮酸氧化酶 | 催化 | 与pta同时删除使乙酸降至<1 g/L，但1-丙醇产量下降40% |
| Escherichia coli | 乙醛酸分流 | iclR | 乙醛酸循环阻遏物 | 调控 | 敲除激活乙醛酸分流，但使1-丙醇产量下降20% |
| Escherichia coli | 全局调控 | arcA | ArcA转录调控因子 | 调控 | 敲除导致1-丙醇滴度下降50%，可能为多效性效应 |
| Escherichia coli | 2-酮丁酸竞争途径 | avtA | 2-酮丁酸氨基转移酶 | 催化 | 与tdcE同时敲除反而使1-丙醇产量下降65% |
| Escherichia coli | 2-酮丁酸竞争途径 | tdcE | 2-酮丁酸甲酸裂解酶 | 催化 | 与avtA同时敲除降低1-丙醇产量 |
| Escherichia coli | 混合酸发酵 | adhE, ldhA, frdA | 乙醇脱氢酶/乳酸脱氢酶/富马酸还原酶 | 催化 | 与pta同时敲除可减少副产物，使1-丙醇滴度提高20%至8 g/L |
关键发现
- 双途径（苏氨酸+柠苹酸）菌株在微好氧条件下1-丙醇产量达0.15 g/g葡萄糖，产率为0.12 g/L/h（约2.5 g/L/day），最高滴度8 g/L
- 单独苏氨酸途径产量0.09 g/g、产率0.04 g/L/h，单独柠苹酸途径产量0.11 g/g、产率0.04 g/L/h
- 理论最大产量计算表明，有氧条件下两途径通量比为1:1时1-丙醇理论产量最高为1.33 mol/mol葡萄糖，而单独途径均为1 mol/mol
- 删除TCA循环（ΔgltA）使苏氨酸途径1-丙醇产量完全丧失，而双途径仅下降30%
- 敲除pta和poxB使乙酸从>3 g/L降至<1 g/L，但1-丙醇产量下降40%
- 培养基置换可实现11天连续生产，平均产率2-3 g/L/day。
研究结论
苏氨酸途径与柠苹酸途径在还原力、ATP需求和TCA循环依赖性上互补，耦合后产生协同效应，显著提高1-丙醇的产量、产率和滴度。途径协同可作为代谢工程通用设计原则，用于改善目标化学品的生产效率。