Utilizing an endogenous pathway for 1-butanol production in Saccharomyces cerevisiae
- 作者
- Tong Si, Yunzi Luo, Han Xiao, Huimin Zhao
- 单位
- Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, IL 61801, USA; Departments of Chemistry, Biochemistry, and Bioengineering, Institute for Genomic Biology, University of Illinois at Urbana-Champaign, Urbana, IL 61801, USA
- 杂志
- Metabolic Engineering（2014）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2014.01.002
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在酿酒酵母中利用内源氨基酸代谢途径实现1-丁醇的微生物合成，并提高产量至可行水平。
研究策略
删除ADH1基因激活内源1-丁醇途径；通过前体饲喂、13C同位素标记和基因敲除表征途径机制；过表达途径酶（苏氨酸合成、转氨、亮氨酸生物合成、脱羧和醇脱氢）并消除竞争途径（ilv2/ilv6/ilv3敲除）以提高1-丁醇产量。
核心内容
本研究在酿酒酵母中首次发现并表征了一条内源1-丁醇合成途径。通过删除ADH1基因激活该途径，adh1Δ菌株在丰富培养基中即可从葡萄糖积累超过120 mg/L的1-丁醇。研究采用前体饲喂、13C同位素标记和基因敲除等手段解析了途径机制，证明外源苏氨酸和甘氨酸并非直接掺入产物，而是通过减少线粒体苏氨酸外流间接刺激生产。在此基础上，通过过表达苏氨酸合成、转氨、亮氨酸生物合成及脱羧/醇脱氢等途径酶，同时敲除ilv2、ilv6、ilv3等竞争途径基因，将产量提升至242.8 ± 21.0 mg/L，较adh1Δ菌株提高106.8%，为当时酿酒酵母中报道的最高值。其中过表达苏氨酸合成途径使首日产量提高280.8%，过表达CHA1和ILV1分别提高73.1%和42.9%。该工作证明酵母内源苏氨酸依赖途径可高效合成1-丁醇且无1-丙醇副产物，为利用工业适性优良的酵母宿主进行生物丁醇生产奠定了基础。
创新点
['首次发现并表征酿酒酵母内源1-丁醇合成途径，单基因敲除ADH1即可开启1-丁醇积累', '阐明外源苏氨酸/甘氨酸通过间接机制（减少线粒体苏氨酸外流）刺激1-丁醇生产，而非直接掺入', '通过代谢工程实现242.8 mg/L的1-丁醇产量，为当时S. cerevisiae中最高报道值']
研究对象（26）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae | 乙醇发酵/1-丁醇氧化 | ADH1 | Adh1p | 催化 | 醇脱氢酶，敲除后激活内源1-丁醇积累；过表达恢复1-丁醇消耗 |
| Saccharomyces cerevisiae | 内源1-丁醇合成途径（苏氨酸→2-酮丁酸） | ILV1 | Ilv1p | 催化 | 苏氨酸脱氨酶，催化L-苏氨酸生成2-酮丁酸；敲除显著降低1-丁醇产量（约23%），过表达提高产量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 内源1-丁醇合成途径（苏氨酸→2-酮丁酸） | CHA1 | Cha1p | 催化 | 苏氨酸脱氨酶同工酶，受L-苏氨酸诱导；过表达比ILV1更有效提高1-丁醇产量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 亮氨酸生物合成途径（2-酮丁酸→2-酮戊酸链延伸） | LEU4 | Leu4p | 催化 | α-异丙基苹果酸合酶，催化2-酮丁酸与乙酰-CoA缩合；敲除几乎消除1-丁醇积累，过表达提高产量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 亮氨酸生物合成途径（2-酮丁酸→2-酮戊酸链延伸） | LEU9 | Leu9p | 催化 | Leu4p同工酶，敲除对1-丁醇产量无明显影响，说明次要作用 |
| Saccharomyces cerevisiae | 亮氨酸生物合成途径（2-酮丁酸→2-酮戊酸链延伸） | LEU1 | Leu1p | 催化 | 异丙基苹果酸异构酶，参与链延伸；敲除显著降低产量，过表达（与LEU4组合）提高51.2% |
| Saccharomyces cerevisiae | 亮氨酸生物合成途径（2-酮丁酸→2-酮戊酸链延伸） | LEU2 | Leu2p | 催化 | α-异丙基苹果酸脱氢酶；实验室菌株leu2背景，额外补充LEU2仅轻微提高产量 |
| Saccharomyces cerevisiae | 缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸生物合成（竞争途径） | ILV2 | Ilv2p | 催化 | 乙酰乳酸合酶，竞争2-酮丁酸和丙酮酸；敲除使1-丁醇产量提高106.8%，达242.8 mg/L |
| Saccharomyces cerevisiae | 缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸生物合成（竞争途径） | ILV6 | Ilv6p | 调控 | 乙酰乳酸合酶调节亚基，敲除使1-丁醇产量提高32.8% |
| Saccharomyces cerevisiae | 缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸生物合成（竞争途径） | ILV3 | Ilv3p | 催化 | 二羟酸脱水酶，敲除使1-丁醇产量提高56.9% |
| Saccharomyces cerevisiae | 苏氨酸生物合成途径 | HOM3 | Hom3p | 催化 | 天冬氨酸激酶，过表达以增加苏氨酸合成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 苏氨酸生物合成途径 | HOM2 | Hom2p | 催化 | 天冬氨酸半醛脱氢酶，过表达以增加苏氨酸合成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 苏氨酸生物合成途径 | HOM6 | Hom6p | 催化 | 高丝氨酸脱氢酶，过表达以增加苏氨酸合成 |
| Saccharomyces cerevisiae | 苏氨酸生物合成途径 | THR1 | Thr1p | 催化 | 高丝氨酸激酶，过表达以增加苏氨酸合成；定位可能在线粒体 |
| Saccharomyces cerevisiae | 苏氨酸生物合成途径 | THR4 | Thr4p | 催化 | 苏氨酸合酶，过表达以增加苏氨酸合成；定位可能在线粒体 |
| Saccharomyces cerevisiae | 内源1-丁醇合成途径（2-酮戊酸→丁醛） | ARO10 | Aro10p | 催化 | 2-酮酸脱羧酶，突变体Aro10p1355Y对2-酮戊酸有偏好，过表达提高产量52.1% |
| Saccharomyces cerevisiae | 内源1-丁醇合成途径（2-酮戊酸→丁醛） | PDC1 | Pdc1p | 催化 | 丙酮酸脱羧酶，对线性2-酮酸（含2-酮戊酸）有活性，但偏好丙酮酸 |
| Saccharomyces cerevisiae | 内源1-丁醇合成途径（2-酮戊酸→丁醛） | PDC5 | Pdc5p | 催化 | 丙酮酸脱羧酶同工酶，性质和Pdc1p类似 |
| Saccharomyces cerevisiae | 内源1-丁醇合成途径（2-酮戊酸→丁醛） | PDC6 | Pdc6p | 催化 | 丙酮酸脱羧酶同工酶，性质和Pdc1p类似 |
| Saccharomyces cerevisiae | 内源1-丁醇合成途径（丁醛→1-丁醇） | ADH2 | Adh2p | 催化 | 醇脱氢酶，可氧化1-丁醇，激活后导致产量下降，建议敲除 |
| Saccharomyces cerevisiae | 内源1-丁醇合成途径（丁醛→1-丁醇） | ADH3 | Adh3p | 催化 | 醇脱氢酶，过表达未促进1-丁醇积累 |
| Saccharomyces cerevisiae | 内源1-丁醇合成途径（丁醛→1-丁醇） | ADH4 | Adh4p | 催化 | 醇脱氢酶，去除线粒体信号肽的胞质突变体第一天提高产量216.5% |
| Saccharomyces cerevisiae | 内源1-丁醇合成途径（丁醛→1-丁醇） | ADH5 | Adh5p | 催化 | 醇脱氢酶，过表达未促进1-丁醇积累 |
| Saccharomyces cerevisiae | 内源1-丁醇合成途径（丁醛→1-丁醇） | ADH6 | Adh6p | 催化 | 醇脱氢酶，过表达与adh1Δ产量相似 |
| Saccharomyces cerevisiae | 内源1-丁醇合成途径（丁醛→1-丁醇） | BDHB | BdhB | 催化 | 来自Clostridium acetobutylicum的丁醇脱氢酶，异源表达未显著提高产量 |
| Escherichia coli (source organism) | 内源1-丁醇合成途径（2-酮戊酸→丁醛） | KIVD | KivD | 催化 | 来自Lactococcus lactis的2-酮酸脱羧酶，异源表达无显著效果 |
关键发现
- adh1Δ菌株在YPAD丰富培养基中从葡萄糖积累超过120 mg/L 1-丁醇
- 通过敲除ILV2获得最高产量242.8 ± 21.0 mg/L（比adh1Δ高106.8%）
- 过表达苏氨酸合成途径（pRS426-THR）第一天产量提升280.8%
- 过表达ILV1和CHA1分别提高42.9%和73.1%
- 过表达LEU4/LEU1提高51.2%
- Aro10p1355Y突变体提高52.1%
- 2-KV转化为1-丁醇的产率在pH不控制时可达0.44 g/g（0.2% KV），理论值0.64 g/g
- 13C标记实验证明外源苏氨酸和甘氨酸的碳未直接进入1-丁醇，产物碳全部来自葡萄糖。
研究结论
本研究证明酿酒酵母存在内源1-丁醇合成途径（苏氨酸依赖型），通过ADH1敲除和代谢工程（过表达途径酶、消除竞争途径）可显著提高产量，最高达242.8 mg/L，为目前S. cerevisiae中最高报道。该途径避免了1-丙醇副产物，且酵母宿主具有鲁棒性和工业适应性，未来可通过进一步系统菌株工程提高效价和生产率。