Geraniol hydroxylase and hydroxygeraniol oxidase activities of the CYP76 family of cytochrome P450 enzymes and potential for engineering the early steps of the (seco)iridoid pathway
- 作者
- René Höfer, Lemeng Dong, François André, Jean-François Ginglinger, Raphael Lugan, Carole Gavia, Sebastien Grec, Gerhard Lang, Johan Memelink, Sander Van Der Krol, Harro Bouwmeester, Danièle Werck-Reichhart
- 单位
- Institut de Biologie Moléculaire des Plantes, CNRS UPR 2357-Université de Strasbourg, France; Laboratory of Plant Physiology, Wageningen University, 6700 AR Wageningen, The Netherlands; CEA, iBiTecS, Service de Bioenergetique Biologie Structurale et Mécanismes (SBS2M), Gif-sur-Yvette, France; Université Lille Nord de France, Lille 1, France; Philip Morris Products S.A., Research & Development, Quai Jeannenaud 5, CH-2000 Neuchâtel, Switzerland; Institute of Biology, Leiden University, Sylvius Laboratory, P.O. Box 9505, 2300 RA Leiden, The Netherlands
- 杂志
- Metabolic Engineering（2013）
- DOI
- 10.1016/j.ymben.2013.08.001
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析(seco)iridoid途径中香叶醇氧化步骤的催化酶，特别是CYP76家族成员的功能，并评估其在异源植物中重构长春花生物碱（如长春碱）生物合成途径的潜力。
研究策略
对CYP76B和CYP76C亚家族的多个成员进行酵母异源表达和酶活分析，结合NMR鉴定产物、同源建模与分子对接解释区域选择性，并通过本氏烟草叶盘实验和瞬时共表达香叶醇合酶与候选P450酶进行体内功能验证和代谢物分析。
核心内容
该研究聚焦于(seco)iridoid途径中香叶醇氧化的关键酶功能解析。作者在酵母WAT11系统中异源表达了CYP76家族多个成员，发现CYP76B6是双功能酶，能连续催化香叶醇生成8-羟基香叶醇（turnover约170 min⁻¹）并进一步氧化为8-氧代香叶醇（turnover约64 min⁻¹），完成iridoid途径前两步，且其催化效率比此前昆虫细胞表达系统测得的高约20倍。同时，研究推翻了CYP76C1具有香叶醇羟化酶活性的专利报道，并新鉴定CYP76C4为较弱的9-/8-羟化酶（Km为21 μM）。在本氏烟草中瞬时共表达香叶醇合酶与CYP76B6可完全消除香叶醇糖苷积累并产生更多氧化产物，而共表达CYP76C4仅使糖苷减少约一半。此外，8-氧代香叶醇会被烟草内源酶进一步还原、氧化和糖基化。这些结果表明CYP76B6是重构iridoid途径的理想候选酶，但后续实现完整TIA生物合成需关注中间产物的通道化或引入下游酶。
创新点
['推翻了CYP76C1具有香叶醇羟化酶活性的专利报道，证明其无此活性，并新鉴定CYP76C4为香叶醇9-/8-羟化酶', '发现CYP76B6是双功能酶，不仅催化香叶醇8-羟化，还继续催化8-羟基香叶醇氧化为8-氧代香叶醇，即iridoid途径的前两步', '通过植物叶盘测定和通路重构实验证明CYP76B6在植物体内能快速完成两步氧化，且其高催化效率可竞争过内源糖基转移酶', '揭示了本氏烟草中8-氧代香叶醇被内源酶还原、氧化和糖基化进一步代谢的现象，提示中间产物通道化的重要性']
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae WAT11 | iridoid途径前两步（香叶醇氧化） | CYP76B6 | CYP76B6 | 催化 | 来自Catharanthus roseus，双功能酶：香叶醇8-羟化酶和8-羟基香叶醇氧化酶 |
| Saccharomyces cerevisiae WAT11 | 香叶醇羟化（萜类代谢） | CYP76C4 | CYP76C4 | 催化 | 来自Arabidopsis thaliana，香叶醇9-/8-羟化酶，产物以9-羟基香叶醇为主 |
| Saccharomyces cerevisiae WAT11 | 香叶醇羟化（阴性对照） | CYP76C1 | CYP76C1 | 催化 | 来自A. thaliana，本研究中未检测到香叶醇羟化活性，否定了此前专利报道 |
| Saccharomyces cerevisiae WAT11 | P450电子传递 | ATR1 | ATR1（P450还原酶） | 能量供给 | 来自A. thaliana，为CYP酶提供还原当量 |
| Nicotiana benthamiana | iridoid途径重构 | VoGES | VoGES（香叶醇合酶） | 催化 | 来自Valeriana officinalis，催化GPP生成香叶醇，与CYP酶共表达 |
| Nicotiana benthamiana | iridoid途径前两步 | CYP76B6 | CYP76B6 | 催化 | 叶片瞬时表达验证体内双功能活性，产物进一步被内源酶代谢 |
关键发现
- ['CYP76C4动力学参数：Km=21±6 μM，kcat=20±1 min⁻¹（以8-和9-羟基香叶醇总和计）', 'CYP76C4催化生成9-和8-羟基香叶醇，比例约为1.3:1', '在200 μM底物浓度下，CYP76B6催化香叶醇生成8-羟基香叶醇的turnover为170±6 min⁻¹，催化8-羟基香叶醇生成8-氧代香叶醇的turnover为64±1 min⁻¹', 'CYP76B6对8-羟基香叶醇的Km值介于3.5-151 μM之间，kcat介于15-37 min⁻¹之间', 'CYP76B6不能进一步代谢8-氧代香叶醇，但能形成未知副产物x', '在本氏烟草叶盘实验中，CYP76B6表达叶片未检测到香叶醇糖苷，而CYP76C4表达叶片仍有香叶醇糖苷残留', '在本氏烟草中单独表达VoGES时，香叶醇主要以糖苷形式积累
- 共表达CYP76C4使香叶醇糖苷减少约一半，共表达CYP76B6则完全消除香叶醇糖苷，并产生更多氧化产物（如8-羧基香叶酸）及其糖苷', 'CYP76B6在酵母中表达时，其香叶醇羟化活性比之前昆虫细胞表达系统测得的kcat高约20倍（推测约170 vs 8 min⁻¹）']
研究结论
CYP76B6（来自长春花）是一种高度区域选择性的双功能香叶醇8-氧化酶，催化iridoid途径的前两步（香叶醇→8-羟基香叶醇→8-氧代香叶醇），且效率足以在异源植物中竞争过内源糖基化反应，是重构(seco)iridoid途径的理想候选酶。CYP76C4则是一种较弱的9/8-羟化酶，可能并非以香叶醇为天然底物。在异源植物中，8-氧代香叶醇会被内源酶进一步代谢，因此后续实现完整TIA途径需要关注中间产物的通道化或引入下游酶。