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Effect of precursor feeding on alkaloid accumulation by a tryptophan decarboxylase over-expressing transgenic cell line T22 of Catharanthus roseus

作者
Serap Whitmer, Robert van der Heijden, Robert Verpoorte
单位
Gorlaeus Laboratories, Division of Pharmacognosy, LACDR, Leiden/Amsterdam Center for Drug Research, Leiden University
杂志
Journal of Biotechnology（2002）
DOI
10.1016/S0168-1656(02)00027-5
所属领域
代谢工程
关键词
Cell cultureGenetic engineeringSecondary metabolismStrictosidine synthaseTerpenoid indole alkaloidsTryptophan decarboxylase
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解决的核心问题

在色氨酸脱羧酶（TDC）过表达的转基因长春花（Catharanthus roseus）细胞系T22中，通过前体饲喂研究萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成的限速步骤，以解释为何该细胞系基础TIA产量低，并探索提高其产量的策略。

研究策略

对T22细胞系进行单次、多次及连续的前体（色氨酸、色胺、马钱苷、断马钱苷）饲喂实验，设置不同浓度（0.2-12.8 mM）和不同添加时间（第0、5、10天），监测细胞生长、TIA组分（胡豆苷、阿吗碱、长春质碱、蛇根碱）积累量及TDC和STR酶活性，并与野生型CRPM细胞系进行比较。

研究路线图

100%
研究问题：T22细胞系基础TIA产量低的原因
策略：对T22细胞系进行前体饲喂实验
前体种类：色氨酸、色胺、马钱苷、断马钱苷
饲喂方案：单次/多次/连续，0.2~12.8 mM
关键发现①：单独色氨酸/色胺饲喂无作用
关键发现②：萜类前体是限速因素
关键发现③：连续饲喂马钱苷/色胺TIA达1250 μmol/l
关键发现④：高浓度下下游转化成为新限制
结论：补加萜类前体提高TIA产量，持续饲喂维持高水平
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核心内容

该研究通过向色氨酸脱羧酶（TDC）过表达的转基因长春花细胞系T22饲喂不同前体，探究了萜类吲哚生物碱（TIA）合成的限速环节。结果显示，对照培养的TIA积累量不足10 μmol/l，单独添加色氨酸或色胺无促进作用，而补加马钱苷或断马钱苷可显著提升TIA产量，表明萜类前体供应是主要限速因素。连续饲喂0.4 mM马钱苷与色胺时，TIA以约200 μmol/l/天的速率积累，第8天达到峰值1250 μmol/l（约625 mg/l），其中约85%为胡豆苷、8%为阿吗碱。然而，高浓度（12.8 mM）前体饲喂使产量降至246.8 μmol/l并抑制细胞生长，说明下游转化（如胡豆苷向阿吗碱的转化）及产物分解成为新的瓶颈。野生型CRPM细胞系在1 mM马钱苷/色胺饲喂下也可积累587 μmol/l TIA。该工作明确了TDC过表达背景下TIA生物合成的关键限速步骤，并提出了通过持续补加萜类前体提高产量的有效策略。

创新点

系统揭示了在TDC过表达背景下，TIA生物合成的主要限速环节位于萜类（马钱苷/断马钱苷）途径；通过连续饲喂马钱苷/色胺使TIA积累达到1250 μmol/l，远超对照；发现高浓度前体下STR仍不是限速因素；对比了转基因T22与野生型CRPM的前体利用差异。

研究对象（3）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Catharanthus roseus 转基因细胞系T22 萜类吲哚生物碱生物合成 Tdc2 色氨酸脱羧酶（TDC） 催化 转基因过表达，催化L-色氨酸脱羧生成色胺
Catharanthus roseus 转基因细胞系T22 萜类吲哚生物碱生物合成 Str 胡豆苷合酶（STR） 催化 内源酶，催化色胺与断马钱苷缩合生成胡豆苷
Catharanthus roseus 野生型细胞系CRPM 萜类吲哚生物碱生物合成 — — 催化 野生型对照，饲喂前体后也能积累TIA，但速率较慢

关键发现

  1. 对照培养TIA积累<10 μmol/l
  2. 单次添加0.4 mM马钱苷后第1天TIA约80 μmol/l，第5天降至36 μmol/l
  3. 连续饲喂0.4 mM马钱苷/色胺时，TIA以约200 μmol/l/天的速率积累，第8天达峰值1250 μmol/l（约625 mg/l），其中约85%为胡豆苷、8%为阿吗碱
  4. 单独饲喂马钱苷或断马钱苷均可增强TIA积累，但断马钱苷效果较差
  5. 色氨酸或色胺单独无作用
  6. 与马钱苷组合可进一步提高积累，6.4 mM马钱苷/色胺饲喂时TIA达1103.8 μmol/l（约575 mg/l），12.8 mM时降至246.8 μmol/l且细胞产量下降
  7. 2 mM和0.4 mM马钱苷单次饲喂的转化率分别约14%（第0天）、12%（第5天）和6%（第10天）
  8. 连续饲喂使马钱苷和色胺累积，但未见断马钱苷累积
  9. TDC活性在饲喂培养中约为对照的一半
  10. 野生型CRPM在1 mM马钱苷/色胺饲喂下，第2天和第14天分别积累114和587 μmol/l TIA。

研究结论

在TDC过表达的长春花细胞系T22中，萜类前体供应是TIA生物合成的关键限速因素；外源补加马钱苷（尤其是与色胺/色氨酸组合）可大幅提高TIA积累，但高浓度下下游转化（如胡豆苷转化为阿吗碱）和产物分解成为新的限制；持续饲喂前体可维持较高的TIA积累水平。