Heterologous production of two unusual acyclic carotenoids, 1,1'-dihydroxy-3,4-didehydrolycopene and 1-hydroxy-3,4,3',4'-tetradehydrolycopene by combination of the crtC and crtD genes from Rhodobacter and Rubrivivax
- 作者
- Sabine Steiger, Shinichi Takaichi, Gerhard Sandmann
- 单位
- Botanisches Institut, Goethe Universität, P.O. Box 111932, D-60054 Frankfurt, Germany; Biological Laboratory, Nippon Medical School, Kawasaki 211-0063, Japan
- 杂志
- Journal of Biotechnology（2002）
- DOI
- 10.1016/S0168-1656(02)00055-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
利用异源组合生物合成策略，在大肠杆菌中生产两种不寻常的无环羟基类胡萝卜素，包括尚未在非转基因生物中发现过的1,1'-二羟基-3,4-双脱氢番茄红素和新的1-羟基-3,4,3',4'-四脱氢番茄红素，并阐明不同来源crtC和crtD基因的底物特异性差异。
研究策略
将来自Rhodobacter capsulatus、Rhodobacter sphaeroides和Rubrivivax gelatinosus的crtC（胡萝卜素水合酶）和crtD（3,4-脱饱和酶）基因与番茄红素或3,4-双脱氢番茄红素生物合成模块组合，在大肠杆菌中构建嵌合类胡萝卜素合成通路。
核心内容
该研究通过将来自荚膜红杆菌、球形红杆菌和胶质红杆菌的crtC（胡萝卜素水合酶）与crtD（3,4-脱饱和酶）基因，分别与番茄红素或3,4-双脱氢番茄红素生物合成模块组合，在大肠杆菌中构建嵌合通路，以生产罕见的无环羟基类胡萝卜素。结果发现，不同来源的CrtC和CrtD底物特异性显著影响产物谱：在3,4-双脱氢番茄红素背景下，胶质红杆菌的CrtD与红杆菌CrtC组合可合成新化合物1-羟基-3,4,3',4'-四脱氢番茄红素（产量101 μg/g dw），而红杆菌CrtD无法催化该反应；胶质红杆菌CrtC还能高效合成1,1'-二羟基-3,4-双脱氢番茄红素（114 μg/g dw），该化合物在非转基因生物中未见报道。在番茄红素背景下，使用红杆菌CrtC替代胶质红杆菌CrtC时，中间产物1-羟基-3,4-双脱氢番茄红素积累至644 μg/g dw，但仅83 μg/g dw被进一步转化。这些结果表明，胶质红杆菌的CrtC和CrtD具有独特的延伸脱氢与高效水合能力，为在大肠杆菌中定向合成特殊结构类胡萝卜素提供了酶学基础。
创新点
首次证明Rubrivivax gelatinosus来源的CrtD能将1-羟基-3,4-双脱氢番茄红素进一步脱氢为1-羟基-3,4,3',4'-四脱氢番茄红素（新化合物），而Rhodobacter来源的CrtD无法催化该反应；发现Rubrivivax来源的CrtC能高效合成1,1'-二羟基-3,4-双脱氢番茄红素，该化合物在非转基因生物中未见报道。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli JM101 | 番茄红素生物合成 | crtE | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 | 催化 | 来自Erwinia uredovora |
| Escherichia coli JM101 | 番茄红素生物合成 | crtB | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 来自Erwinia uredovora |
| Escherichia coli JM101 | 番茄红素生物合成 | crtI | 八氢番茄红素脱饱和酶 | 催化 | 来自Erwinia uredovora，催化生成番茄红素 |
| Escherichia coli JM101 | 3,4-双脱氢番茄红素生物合成 | al-1 | 类胡萝卜素脱饱和酶 | 催化 | 来自Neurospora crassa，催化生成3,4-双脱氢番茄红素 |
| Escherichia coli JM101 | 无环羟基类胡萝卜素合成 | crtC | 胡萝卜素水合酶 | 催化 | 来自Rhodobacter capsulatus或Rubrivivax gelatinosus |
| Escherichia coli JM101 | 无环羟基类胡萝卜素合成 | crtD | 类胡萝卜素3,4-脱饱和酶 | 催化 | 来自Rhodobacter sphaeroides或Rubrivivax gelatinosus |
关键发现
- 在3,4-双脱氢番茄红素背景下，Rubrivivax crtD与Rhodobacter crtC组合时，1-HO-3',4'-双脱氢番茄红素产量267 μg/g dw，1-HO-3,4,3',4'-四脱氢番茄红素101 μg/g dw，demethylspheroidene 85 μg/g dw，1,1'-(HO)2-3,4,3',4'-四脱氢番茄红素99 μg/g dw
- 当使用Rhodobacter crtD替代Rubrivivax crtD时，不能合成1-HO-3,4,3',4'-四脱氢番茄红素，主要产物为1,1'-(HO)2-番茄红素（121 μg/g dw）等
- 在番茄红素背景下，Rubrivivax crtC和crtD共同表达时，1-HO-3,4-双脱氢番茄红素83 μg/g dw，1,1'-(HO)2-3,4-双脱氢番茄红素114 μg/g dw，1,1'-(HO)2-3,4,3',4'-四脱氢番茄红素232 μg/g dw
- 用Rhodobacter crtC替代Rubrivivax crtC时，1-HO-3,4-双脱氢番茄红素积累至644 μg/g dw，而只有83 μg/g dw转化为后续产物
- 新化合物1-HO-3,4,3',4'-四脱氢番茄红素相对分子质量550，含1个羟基
- 1,1'-(HO)2-3,4-双脱氢番茄红素相对分子质量570，含2个羟基。
研究结论
通过组合来自不同光合细菌的crtC和crtD基因，在大肠杆菌中成功合成了罕见的无环羟基类胡萝卜素，包括新化合物1-羟基-3,4,3',4'-四脱氢番茄红素和稀有的1,1'-二羟基-3,4-双脱氢番茄红素。Rubrivivax gelatinosus的CrtD和CrtC具有独特的底物特异性，能够延伸脱氢和高效水合，从而产生这些特殊类胡萝卜素。