Biochemical study on ubiquinone biosynthesis in Escherichia coli : I. Specificity of para hydroxybenzoate polyprenyltransferase.
- 作者
- Zakia EL HACHIMI, Odile SAMUEL, Robert AZERAD
- 单位
- Institut de Biochimie, Université de Paris XI, 91 405 - Orsay, France
- 杂志
- Biochimie（1974）
- DOI
- 10.1016/S0300-9084(74)80017-9
- 所属领域
- 代谢生物化学
- 关键词
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解决的核心问题
研究大肠杆菌中辅酶Q生物合成中对羟基苯甲酸聚异戊二烯转移酶（p-hydroxybenzoate polyprenyltransferase）对聚异戊二烯侧链长度的特异性，并建立一种可检测ubiA突变株的体外酶活测定方法。
研究策略
利用[14C]对羟基苯甲酸和不同[3H]聚异戊二烯焦磷酸作为底物，在细胞抽提物中测定聚异戊二烯转移酶和3-聚异戊二烯-4-羟基苯甲酸脱羧酶的活性，并结合缺陷突变株（83-1和2-45）进行互补与竞争实验，分析不同侧链长度前体的利用情况。
核心内容
该研究以大肠杆菌辅酶Q生物合成途径为对象，考察对羟基苯甲酸聚异戊二烯转移酶对侧链长度的底物特异性，并建立体外酶活检测体系。作者利用[14C]对羟基苯甲酸与不同链长的[3H]聚异戊二烯焦磷酸（法尼基C15、植基C20、solanesyl C45）作为底物，在野生型及ubiA缺陷菌株83-1和2-45的抽提物中测定转移酶与下游脱羧酶活性，并通过互补和竞争实验区分各酶的偏好。结果显示，2-45菌株无法合成Q-8和MK-8，却积累DMK-8，证实其缺乏对羟基苯甲酸八异戊二烯转移酶活性。外源供体实验中，C15底物活性最高（15 nmol时形成11,400 dpm产物），C20和C45分别为1,670和1,500 dpm，且高浓度C20强烈抑制反应；竞争实验表明内源八异戊二烯焦磷酸被优先利用。关键的是，转移酶可接受不同链长底物，但脱羧酶仅能识别内源生成的3-八异戊二烯-4-羟基苯甲酸，外源C15/C20/C45形成的产物均无法被脱羧。这说明辅酶Q侧链长度的精确性由脱羧酶的严格底物特异性决定，而非转移酶本身，为理解泛醌链长控制机制提供了直接生化证据。
创新点
建立了以人工合成的聚异戊二烯焦磷酸（如法尼基、植基、solanesyl焦磷酸）为外源供体的体外酶活检测系统；通过竞争实验直接证明了对羟基苯甲酸聚异戊二烯转移酶对侧链长度无严格特异性，而脱羧酶严格特异性识别八异戊二烯底物。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli K12 | ubiquinone biosynthesis | ubiA | p-hydroxybenzoate polyprenyltransferase | 催化 | 催化对羟基苯甲酸与聚异戊二烯焦磷酸缩合，对侧链长度无严格特异性；2-45突变株中该酶活性缺失。 |
| Escherichia coli K12 | ubiquinone biosynthesis | — | 3-polyprenyl 4-hydroxybenzoate decarboxylase | 催化 | 严格特异性识别3-八异戊二烯-4-羟基苯甲酸，催化脱羧生成2-辛异戊二烯苯酚；外源短链PPHB不能被脱羧。 |
| Escherichia coli K12 | menaquinone biosynthesis | — | S-adenosylmethionine-desmethylmenaquinone methyltransferase | 催化 | 2-45突变株同时缺乏该酶，导致只积累DMK-8（0.36-0.40 μmol/g干重）而无MK-8。 |
| Escherichia coli W (strain 83-1) | aromatic amino acid biosynthesis / ubiquinone biosynthesis | — | — | 催化 | 83-1菌株阻断于脱氢奎尼酸与脱氢莽草酸之间，需补充p-羟基苯甲酸和o-琥珀酰苯甲酸以分别合成Q-8和MK-8；用于积累内源八异戊二烯焦磷酸前体。 |
| Escherichia coli K12 (strain 2-45) | ubiquinone biosynthesis / menaquinone biosynthesis | ubiA | — | 调控 | 该突变株不能合成Q-8和MK-8，但能积累八异戊二烯焦磷酸；与83-1抽提物互补后恢复PPHB合成（14C掺入约5700 dpm）。 |
关键发现
- 2-45菌株在好氧或半厌氧条件下均不能合成Q-8和MK-8，但积累0.36-0.40 μmol/g干重的DMK-8，且添加p-羟基苯甲酸不能恢复Q-8合成，证实其缺乏p-羟基苯甲酸八异戊二烯转移酶活性。
- 在83-1菌株抽提物中，用[14C]p-羟基苯甲酸和[3H]solanesyl-PP可形成3-壬异戊二烯-4-羟基苯甲酸（14C掺入1840 dpm），而只用[14C]p-羟基苯甲酸时因内源前体消耗而无产物（0 dpm）；内源前体存在时掺入达4100 dpm。
- 外源聚异戊二烯焦磷酸中，法尼基-PP（C15）活性最高（15 nmol时形成11,400 dpm PPHB），植基-PP（C20）为1,670 dpm，solanesyl-PP（C45）为1,500 dpm；高浓度植基-PP（>12 μM）强烈抑制反应。
- 竞争实验中，内源八异戊二烯焦磷酸被优先利用，外源solanesyl-PP浓度达20 μM时总PPHB形成减少，但约30%活性保持不变。
- 3-聚异戊二烯-4-羟基苯甲酸脱羧酶仅能将内源生成的3-八异戊二烯-4-羟基苯甲酸脱羧为2-辛异戊二烯苯酚，外源C15/C20/C45形成的PPHB均不能被脱羧。
研究结论
大肠杆菌中的p-羟基苯甲酸聚异戊二烯转移酶对聚异戊二烯侧链长度不具有特异性，而下游的3-聚异戊二烯-4-羟基苯甲酸脱羧酶严格特异性识别八异戊二烯底物；辅酶Q侧链长度的精确性不仅依赖于聚异戊二烯焦磷酸合成系统，还取决于脱羧酶的高度底物特异性。