高级醇 · 代谢工程文献库

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Positioning proton-donating residues to the Schiff-base accelerates the M-decay of pharaonis phorbohodopsin expressed in Escherichia coli

作者
Masayuki Iwamoto, Kazumi Shimono, Masato Sumi, Naoki Kamo
单位
Laboratory of Biophysical Chemistry, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University
杂志
Biophysical Chemistry（1999）
DOI
10.1016/s0301-4622(99)00054-x
所属领域
生物物理化学
关键词
Expression in E. coliM-decay of mutantsPharaonis phorbohodopsin (ppR)Pharaonis sensory rhodopsin (psR-II)Photocycle
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解决的核心问题

pharaonis phoborhodopsin (ppR) 光循环中 M-中间体的衰变速率远慢于细菌视紫红质 (bR)，可能原因是 ppR 缺乏向 Schiff 碱提供质子的残基（对应 bR 的 Asp96 和 Thr46）。

研究策略

在大肠杆菌中异源表达 ppR 及其定点突变体 F86D、L40T 和 F86D/L40T，通过闪光光解光谱测定光循环中间体动力学，比较不同 pH 下 M-衰变速率常数。

研究路线图

100%
研究问题：ppR光循环M-衰变慢于bR，缺乏质子供体残基
关键数据（pH5）
k1=5.2 s^-1
k1=11 s^-1
策略：在大肠杆菌中异源表达ppR及F86D、L40T、双突变体，闪光光解测动力学
关键改造：引入bR同源质子供体（F86D~Asp96，L40T~Thr46）
结果：双突变体M-衰变速率k1达190 s^-1（pH5），接近bR（300~200 s^-1）
结论：重建质子传递链，证实缺乏质子供体残基是ppR慢光循环的原因
野生型 ppR（对照组）
F86D 突变体
L40T 突变体
F86D/L40T 双突变体
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核心内容

该研究在大肠杆菌中异源表达了光敏蛋白pharaonis phoborhodopsin（ppR）及其定点突变体，旨在验证ppR光循环中M-中间体衰变缓慢是否源于其缺乏向Schiff碱提供质子的残基。作者参照细菌视紫红质（bR）中Asp96和Thr46的功能，构建了F86D、L40T单突变体及F86D/L40T双突变体，并通过闪光光解光谱测定不同pH下M-衰变速率常数。结果表明，双突变体在pH 5.0、7.0和9.0下的衰变速率常数分别达到190、97和13 s⁻¹，较野生型在pH 5.0加速约36倍，在pH 7.0加速约130倍；其中pH 5.0时半衰期仅3.6 ms，已接近bR的300–200 s⁻¹。F86D单突变体也有明显加速效果，但L40T单独作用较弱。这些结果证明引入bR的质子供体残基可重建从细胞质侧到去质子化Schiff碱的质子传递链，从而显著加速M-中间体衰变，有力支持了ppR慢光循环归因于缺乏质子供体残基的假说。

创新点

首次在大肠杆菌中功能性表达 ppR 突变体，通过引入 bR 的质子供体残基（Asp96/Thr46 同源位点）成功加速 M-衰变，双突变体速率接近 bR。

研究对象（4）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Escherichia coli BL21(DE3) ppR 光循环 pspII pharaonis phoborhodopsin (ppR) wild-type 转运 光受体蛋白，光循环中涉及 Schiff 碱质子化/去质子化；野生型 M-衰变较慢。
Escherichia coli BL21(DE3) ppR 光循环 pspII (F86D) F86D mutant ppR 转运 Phe86 突变为 Asp，对应 bR 的 Asp96，作为质子供体，加速 M-衰变。
Escherichia coli BL21(DE3) ppR 光循环 pspII (L40T) L40T mutant ppR 转运 Leu40 突变为 Thr，对应 bR 的 Thr46，可能影响质子传递网络。
Escherichia coli BL21(DE3) ppR 光循环 pspII (F86D/L40T) F86D/L40T double mutant ppR 转运 双突变体，M-衰变速率接近 bR，重建质子传递链。

关键发现

  1. F86D 突变体的 M-衰变速率常数 (k1) 在 pH5.0、7.0、9.0 分别为
  2. 2.3、0.69 s^-1，野生型则为
  3. 2、0.75、0.46 s^-1；F86D/L40T 双突变体的 k1 分别为
  4. 97、13 s^-1，相较野生型在 pH5.0 加速约 36 倍，pH7.0 加速约 130 倍；pH5.0 时双突变体 k1=190 s^-1（T1/2=3.6 ms），接近 bR 的 300-200 s^-1；L40T 单突变体的 k1 在 pH5.0、7.0、9.0 分别为
  5. 2.8、0.40 s^-1。

研究结论

将 bR 中 Asp96 和 Thr46 对应的残基引入 ppR（F86D 和 L40T 突变）可显著加速 M-中间体衰变，双突变体速率接近 bR，表明重建了从细胞质侧到去质子化 Schiff 碱的质子传递链，该结果支持 ppR 慢光循环归因于缺乏质子供体残基的假说。