Multigene engineering: dawn of an exciting new era in biotechnology
- 作者
- Henry Daniell, Amit Dhingra
- 单位
- Department of Molecular Biology and Microbiology, University of Central Florida, 12722 Research Parkway, Orlando, Florida 32826-3227, USA
- 杂志
- Current Opinion in Biotechnology（2002）
- DOI
- 10.1016/S0958-1669(02)00297-5
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
植物多基因工程面临基因沉默、位置效应、多基因叠加需耗时有种、花粉介导的基因扩散等挑战，以及多亚基蛋白和代谢通路的协调表达难题。核基因组难以处理多顺反子，叶绿体基因组则提供了一种解决方案。
研究策略
本综述通过比较核基因工程和叶绿体基因工程在多基因表达中的应用，重点介绍了叶绿体基因组利用多顺反子转录、同源重组定点插入、植物源选择标记、异源UTR等策略，实现多基因协同表达和高产物积累。
核心内容
该综述系统比较了核基因组与叶绿体基因组在多基因工程中的应用，重点阐述了叶绿体作为多基因协同表达平台的优势。叶绿体基因组能够利用多顺反子转录、同源重组定点插入、异源UTR等策略，以单一启动子协调表达多个基因，避免了核转基因常见的基因沉默、位置效应及耗时的杂交育种。研究证明，叶绿体可直接翻译细菌操纵子而不需加工为单顺反子，例如将苏云金芽孢杆菌cry2Aa2操纵子导入烟草叶绿体后，Cry2Aa2蛋白积累量高达总可溶蛋白的46.1%，形成杀虫晶体并可杀死具有40,000倍抗性的昆虫；霍乱毒素B亚基在叶绿体中的表达量比核转基因高410倍且正确组装为功能性寡聚体；人血清白蛋白经优化UTR后以多顺反子形式实现迄今最高水平的药用蛋白表达。此外，植物源甜菜碱醛脱氢酶作为选择标记比抗生素抗性基因高效25倍，实现无抗生素筛选；通过母系遗传可有效限制花粉介导的基因扩散。在代谢通路工程方面，四基因构建体在拟南芥中表达PHB合成途径使聚合物积累达4%鲜重，但严重影响生长；水稻胚乳成功导入β-胡萝卜素合成途径三个酶。这些结果确立了叶绿体基因工程作为后基因组时代多基因工程重要平台的地位。
创新点
1) 证明叶绿体可翻译多顺反子而不需加工为单顺反子；2) 实现了细菌操纵子的叶绿体表达，形成杀虫晶体；3) 创纪录地使外源蛋白积累达46.1% tsp；4) 利用植物源BADH实现无抗生素筛选；5) 通过异源UTR和5'调控序列显著增强了易降解蛋白的表达；6) 证明叶绿体表达可避免核转基因的基因沉默和位置效应。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 水稻（Oryza sativa）胚乳 | β-胡萝卜素（维生素A前体）生物合成 | psy, pds, lcy | 八氢番茄红素合酶、八氢番茄红素脱氢酶、番茄红素β-环化酶 | 催化 | 通过三个载体共转化，靶向胚乳质体，获得富含维生素A的金稻 |
| 拟南芥（Arabidopsis thaliana） | 聚羟基丁酸酯（PHB）合成 | phbA, phbB, phbC | β-酮硫解酶、乙酰乙酰CoA还原酶、PHB合酶 | 催化 | 使用四基因构建体（含选择标记），PHB积累达4%鲜重，但影响生长和育性 |
| 烟草（Nicotiana tabacum）叶绿体 | 外源药物蛋白表达 | HSA | 人血清白蛋白 | 调控 | 最初表达量<0.02% tsp，优化UTR后以双顺反子/多顺反子高表达，形成包涵体，易于纯化 |
| 烟草（Nicotiana tabacum）叶绿体 | 疫苗抗原表达 | ctxB | 霍乱毒素B亚基 | 调控 | 表达量比核转基因高410倍，正确组装功能性寡聚体，无多效性 |
| 烟草（Nicotiana tabacum）叶绿体 | 抗菌肽表达 | MSI-99 | 抗菌肽MSI-99 | 调控 | 以双顺反子表达，抑制多种植物病原菌和耐药人病原菌，叶绿体裂解后释放高剂量 |
| 烟草（Nicotiana tabacum）叶绿体 | 海藻糖合成（干旱耐受） | tps1 | 海藻糖-6-磷酸合酶 | 催化 | 叶绿体表达无多效性，植株可耐6% PEG并复水，转录本比核转基因高17,000% |
| 烟草（Nicotiana tabacum）叶绿体 | 杀虫蛋白表达 | cry2Aa2 operon (cry2Aa2, orf1, orf2) | Cry2Aa2杀虫晶体蛋白（及Orf2伴侣蛋白） | 调控 | 4.0 kb操纵子完整表达，Cry2Aa2达46.1% tsp，形成杀虫晶体，可杀死高抗性棉铃虫 |
| 烟草（Nicotiana tabacum）叶绿体 | 单克隆抗体表达 | Guy's 13 抗体重链和轻链基因 | Guy's 13 单克隆抗体（抗变形链球菌表面蛋白） | 调控 | 正确组装二硫键，首个在叶绿体中表达的多亚基抗体，可预防龋齿 |
| 烟草（Nicotiana tabacum）叶绿体 | 汞解毒（植物修复） | merA, merB | 汞离子还原酶、有机汞裂解酶 | 催化 | 表达mer操纵子，用于汞/有机汞污染修复 |
| 烟草（Nicotiana tabacum）叶绿体 | 选择标记（无抗生素） | BADH | 甜菜碱醛脱氢酶 | 催化 | 植物源选择标记，效率比抗生素抗性基因高25倍，两周内再生 |
关键发现
- 在'金稻'水稻中成功导入β-胡萝卜素合成途径的三个酶，使胚乳积累维生素A前体
- 在拟南芥中通过四基因构建体表达PHB合成途径，PHB积累达4%鲜重，但严重影响生长
- 人血清白蛋白在叶绿体中经优化UTR后以双/多顺反子高表达，形成包涵体，是迄今为止最高水平的药用蛋白表达
- 霍乱毒素B亚基在叶绿体中表达量比核转基因高410倍，并正确组装成功能性寡聚体
- 抗菌肽MSI-99在叶绿体中表达，释放800 μg即可抑制1000个细菌/真菌孢子
- 海藻糖-6-磷酸合酶在叶绿体中表达比最佳核转基因植株的转录本高17,000%，且无多效性
- 苏云金芽孢杆菌cry2Aa2操纵子在叶绿体中表达，Cry2Aa2蛋白积累达46.1% tsp，形成杀虫晶体，可杀死高达40,000倍抗性的昆虫
- 植物源选择标记BADH比抗生素抗性基因高效25倍，两周内再生。
研究结论
叶绿体基因工程能够以单个启动子协调表达多个基因，实现细菌操纵子和多亚基药物蛋白的高水平表达，避免核转基因的基因沉默、位置效应及耗时的杂交育种，同时通过母系遗传实现基因限制，是后基因组时代多基因工程的重要平台。