Enhanced Diterpene Tanshinone Accumulation and Bioactivity of Transgenic Salvia miltiorrhiza Hairy Roots by Pathway Engineering
- 作者
- Min Shi, Xiuqin Luo, Guanhua Ju, Leilei Li, Shengxiong Huang, Tong Zhang, Huizhong Wang, Guoyin Kai
- 单位
- Zhejiang Provincial Key Laboratory for Genetic Improvement and Quality Control of Medicinal Plants, Hangzhou Normal University; Institute of Plant Biotechnology, Development Center of Plant Germplasm Resources, College of Life and Environment Sciences, Shanghai Normal University; Experiment Center For Teaching & Learning, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine; Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences
- 杂志
- Journal of Agricultural and Food Chemistry（2016）
- DOI
- 10.1021/acs.jafc.5b04697
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
丹参中丹参酮天然含量低，难以满足临床需求，需要通过基因工程手段提高丹参毛状根中二萜类丹参酮的积累。
研究策略
采用'推-拉'策略，将MEP途径上游关键酶SmDXSII和下游香叶基香叶基二磷酸合酶（SmGGPPS）同时导入丹参毛状根，增强前体供应并促进下游丹参酮合成。
核心内容
针对丹参毛状根中丹参酮含量低的问题，本研究采用“推-拉”代谢工程策略，将MEP途径上游限速酶SmDXSII与下游香叶基香叶基二磷酸合酶SmGGPPS在丹参毛状根中共表达，同时增强前体供应与下游二萜合成通量。结果显示，双基因共表达株系GDII10的总丹参酮含量达到12.93 mg/g干重，约为对照（0.61 mg/g）的21倍，也显著高于单基因高表达株系（约4.95 mg/g），创下当时基因工程提高丹参酮含量的纪录。共表达还显著上调了CPS和KSL等下游关键基因的表达（分别提高16–33倍和7–16倍）。在模式植物拟南芥中验证了该策略的通用性，转基因植株中赤霉素含量达5.94 mg/g，为对照的5.8倍，叶绿素和类胡萝卜素含量亦明显增加。此外，转基因毛状根提取物表现出更强的DPPH自由基清除活性和对NCI-H460肺癌细胞的抑制效果。该研究证明共表达DXS与GGPPS是协同提升质体异戊二烯途径产物积累的有效策略，为丹参酮的规模化生产及活性提升提供了可行途径。
创新点
首次在异戊二烯生产植物（包括丹参和拟南芥）中同时共表达DXS和GGPPS基因；双基因转化株系GDII10的丹参酮产量达到12.93 mg/g干重，为当时基因工程获得丹参酮含量的最高记录；证明了共表达策略对抗氧化和抗肿瘤活性的提升作用。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | MEP途径/丹参酮生物合成 | SmDXSII | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | MEP途径第一个关键酶，过表达增强上游前体供应 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 二萜生物合成/丹参酮生物合成 | SmGGPPS | 香叶基香叶基二磷酸合酶 | 催化 | 催化GGPP合成，是二萜前体的关键酶 |
| 拟南芥（Arabidopsis thaliana） | MEP途径 | SmDXSII | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | 异源表达验证对叶绿素、赤霉素等的影响 |
| 拟南芥（Arabidopsis thaliana） | MEP途径/类胡萝卜素生物合成 | SmGGPPS | 香叶基香叶基二磷酸合酶 | 催化 | 异源表达提高类胡萝卜素、叶绿素和激素含量 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | MVA途径/丹参酮生物合成 | HMGR | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | 双基因转化株系中表达上调2-5倍 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | MEP途径 | DXR | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 | 催化 | 双基因株系中表达无明显变化 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 异戊二烯生物合成 | IPPI | 异戊烯基焦磷酸异构酶 | 催化 | 双基因株系中表达明显升高 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮生物合成 | CPS | 柯巴基二磷酸合酶 | 催化 | 双基因GDII株系中表达提高16-33倍 |
| 丹参（Salvia miltiorrhiza）毛状根 | 丹参酮生物合成 | KSL | 类贝壳杉烯合酶 | 催化 | 双基因GDII株系中表达提高7-16倍 |
关键发现
- 双基因转化株系GDII10总丹参酮含量达12.93 mg/g干重，是对照（0.61 mg/g）的约21倍，是单基因高表达株系（G42和DII47约4.95 mg/g）的近3倍
- SmDXSII单基因株系丹参酮含量为2.02-4.58 mg/g，SmGGPPS单基因株系最高4.95 mg/g
- 双基因株系中HMGR表达量比对照提高2-5倍，CPS和KSL表达量分别提高16-33倍和7-16倍
- 转基因拟南芥中总叶绿素含量最高达2.36 mg/g（对照1.18 mg/g），类胡萝卜素最高0.36 mg/g（对照0.26 mg/g），赤霉素达5.94 mg/g（对照的5.8倍），吲哚乙酸达2.75 mg/g（对照0.31 mg/g）
- 转基因毛状根提取物表现出更强的DPPH自由基清除活性和对NCI-H460肺癌细胞的抑制作用。
研究结论
共表达SmGGPPS和SmDXSII可协同提高丹参毛状根中丹参酮及其他质体途径异戊二烯的积累，是一种有效的代谢工程策略，可用于丹参酮的大规模生产。