Pathway Construction in Corynebacterium glutamicum and Strain engineering to Produce Rare Sugars from Glycerol
- 作者
- Jiangang Yang, Yueming Zhu, Yan Men, Shangshang Sun, Yan Zeng, Ying Zhang, Yuanxia Sun, Yanhe Ma
- 单位
- National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes, Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China
- 杂志
- J. Agric. Food Chem.（2017）
- DOI
- 10.1021/acs.jafc.6b03423
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
从廉价的甘油底物高效合成稀有酮糖，解决DHAP不稳定、醛受体供应不足以及产量低的问题。
研究策略
将稀有酮糖合成途径模块化为内源DHAP合成、异源醛合成和醛缩反应三个模块，在谷氨酸棒杆菌中组装不同来源的醛缩酶途径，并通过基因敲除和发酵优化实现高产。
核心内容
该研究在谷氨酸棒杆菌中构建了从廉价甘油合成多种稀有酮糖的模块化途径，将整个合成路线拆分为内源DHAP供给、异源醛合成和醛缩反应三个模块。作者引入基于GlpF/DhaD/DhaK的新型甘油同化途径，并筛选出高活性的马肝醇脱氢酶催化甘油生成L-甘油醛，同时组装了四种不同来源的醛缩酶途径。通过敲除tpi和cgl0331基因减少副产物分流，结合补料分批发酵优化，最终实现多种稀有糖的克级合成：5-脱氧阿洛酮糖最高产量达38.1 g/L，L-果糖经优化后产量提高2.7倍至14.64 g/L，进一步补料发酵获得20.8 g/L L-果糖和10.3 g/L L-塔格糖。敲除cgl0331使L-果糖产量提高75%，额外敲除tpi后得率提升2.5倍至理论值的92%。该策略通过模块化设计和菌株工程有效解决了DHAP不稳定和醛受体供应不足的问题，证明了从醇类底物合成稀有糖的可行性，为其他稀有糖的微生物生产提供了借鉴。
创新点
构建了基于GlpF/DhaD/DhaK的新型甘油同化途径，筛选出催化甘油生成L-甘油醛的高活性马肝醇脱氢酶（HLADH），组装四种醛缩酶途径，并通过敲除tpi和cgl0331及补料分批发酵实现多种稀有酮糖的克级合成。
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 谷氨酸棒杆菌 ATCC13032 及其衍生菌株 | 甘油同化途径 | glpF | GlpF | 转运 | 甘油协助扩散因子，来自大肠杆菌 |
| 谷氨酸棒杆菌 ATCC13032 及其衍生菌株 | 甘油同化途径 | dhaD | DhaD | 催化 | 甘油脱氢酶，来自肺炎克雷伯菌 |
| 谷氨酸棒杆菌 ATCC13032 及其衍生菌株 | 甘油同化途径 | dhaK | DhaK | 催化 | ATP依赖的二羟丙酮激酶，来自弗氏柠檬酸杆菌 |
| 谷氨酸棒杆菌 ATCC13032 及其衍生菌株 | L-甘油醛合成途径 | hladh | HLADH | 催化 | 马肝醇脱氢酶，催化甘油生成L-甘油醛 |
| 谷氨酸棒杆菌 ATCC13032 及其衍生菌株 | 3-羟基丙醛合成途径 | dhaB123 | DhaB | 催化 | 甘油脱水酶，来自肺炎克雷伯菌，催化甘油生成3-羟基丙醛 |
| 谷氨酸棒杆菌 ATCC13032 及其衍生菌株 | 3-羟基丙醛合成途径 | gdrAB | GdrAB | 调控 | 甘油脱水酶再激活因子，来自肺炎克雷伯菌 |
| 谷氨酸棒杆菌 ATCC13032 及其衍生菌株 | 醛缩反应途径（5-脱氧糖/L-果糖合成） | rhaD | RhaD | 催化 | 鼠李糖-1-磷酸醛缩酶，来自大肠杆菌 |
| 谷氨酸棒杆菌 ATCC13032 及其衍生菌株 | 醛缩反应途径（5-脱氧糖/L-塔格糖合成） | fucA | FucA | 催化 | 岩藻糖-1-磷酸醛缩酶，来自大肠杆菌 |
| 谷氨酸棒杆菌 ATCC13032 及其衍生菌株 | 醛缩反应途径（5-脱氧果糖/L-山梨糖/L-阿洛酮糖合成） | fbaA | FruA | 催化 | 果糖-1,6-二磷酸醛缩酶 |
| 谷氨酸棒杆菌 ATCC13032 及其衍生菌株 | 醛缩反应途径（5-脱氧果糖合成） | gatY | TagA | 催化 | 塔格糖-1,6-二磷酸醛缩酶 |
| 谷氨酸棒杆菌 ATCC13032 及其衍生菌株 | 醛缩反应途径 | yqaB | YqaB | 催化 | 果糖-1-磷酸酶，来自大肠杆菌，去磷酸化释放稀有酮糖 |
| 谷氨酸棒杆菌 SY6/SY39 | 糖酵解途径 | tpi | TPI | 催化 | 磷酸丙糖异构酶，敲除后DHAP积累增加20倍 |
| 谷氨酸棒杆菌 SY14/SY39 | 醛降解（副产物形成） | cgl0331 | Cgl0331 | 催化 | Zn依赖性醇脱氢酶，催化L-甘油醛还原为甘油，敲除可提高L-糖产量 |
关键发现
- 新型甘油同化途径使WT(pEFDK)菌株的甘油消耗速率较WT(pEFKD)提高0.7-3.0倍，最终细胞量提高3倍
- 以甘油和L-甘油醛为底物，WT(pXRTY/pEFDK)合成4.3 g/L L-果糖
- 补料分批发酵中，菌株SY6(pXRTY/pEFDhaBA)产生14.5 g/L 5-脱氧山梨糖和8.0 g/L 5-脱氧阿洛酮糖（得率0.85±0.03 mol/mol甘油），SY6(pXFucATY/pEFDhaBA)产生38.1 g/L 5-脱氧阿洛酮糖（得率0.91±0.04），SY6(pXFTY/pEFDhaBA)产生10.8 g/L 5-脱氧果糖
- 副产物DHA 4.1 g/L、1,3-丙二醇1.8 g/L、乳酸1.6 g/L、乙酸0.6 g/L
- 敲除cgl0331使L-果糖产量提高75%至5.28 g/L，进一步敲除tpi使L-果糖得率提高2.5倍（达理论值92%）
- 优化后L-果糖产量和得率分别提高2.7倍和3.1倍（14.64 g/L，0.32±0.02 mol/mol甘油）
- 最终补料分批发酵获得20.8 g/L L-果糖（得率0.21±0.03），10.3 g/L L-塔格糖（得率0.12±0.02），1.2 g/L L-山梨糖和0.95 g/L L-阿洛酮糖。
研究结论
本研究通过模块化组装和菌株工程，在谷氨酸棒杆菌中实现了从甘油合成多种稀有酮糖，最高产量达38.1 g/L（5-脱氧阿洛酮糖）和20.8 g/L（L-果糖），证明该策略可行，为利用其他醇类原料生产稀有糖提供了新思路。