Improvement of a P450-Based Recombinant Escherichia coli Whole-Cell System for the Production of Oxygenated Sesquiterpene Derivatives
- 作者
- Thuy T. B. Ly, Alexander Schifrin, Bach Duc Nguyen, Rita Bernhardt
- 单位
- Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology (VAST); Institute of Biochemistry, Saarland University; Department of Molecular Biology, Faculty of Biotechnology, Vietnam National University of Agriculture
- 杂志
- Journal of Agricultural and Food Chemistry（2017）
- DOI
- 10.1021/acs.jafc.7b00792
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
CYP264B1重组大肠杆菌全细胞系统转化倍半萜时存在底物挥发性高以及P450氧化还原伴侣适配性差的问题，导致转化效率低。
研究策略
采用2-羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）包合挥发性底物以防损失，并构建含CYP264B1/Adx4-108/AdR的三顺反子载体，与含Fpr的旧系统比较，优化电子传递链，最终在200 mL规模下优化底物浓度。
核心内容
针对CYP264B1重组大肠杆菌全细胞催化倍半萜氧化效率低的问题，本研究从底物供给和电子传递链两方面进行系统优化。利用2-羟丙基-β-环糊精包合挥发性倍半萜底物以减少损失，并构建了共表达CYP264B1、截短肾上腺皮质铁氧还蛋白Adx4-108及其还原酶AdR的三顺反子载体，替代原先基于大肠杆菌Fpr的还原系统。结果显示，在铝箔包裹烧瓶中，环糊精使(+)-α-longipinene转化率由5.2%提升至57.1%；改用AdR系统后24小时产物产量提高24.8%。在200 mL规模下，优化底物浓度为300 μM时，三种倍半萜的主要氧化产物（12-羟基-α-longipinene、isolongifolene-9-one和5-羟基-α-humulene）产量分别达54.2、34.2和47.2 mg/L/天，转化率最高达82.1%；在200 μM底物浓度下(+)-α-longipinene转化率可达94.7%，总转化率较原系统提高77.1%。该策略有效解决了挥发底物损失和电子传递效率两大瓶颈，为倍半萜含氧衍生物的绿色生物合成提供了高效通用平台。
创新点
1) 首次将HP-β-CD应用于CYP264B1全细胞倍半萜转化，显著提高挥发底物的固定与转化；2) 构建了pETC4AA三顺反子载体（CYP264B1-Adx4-108-AdR），替代Fpr还原酶系统，提高了产物产量；3) 系统优化了底物浓度，并成功应用于三种不同结构倍半萜的高效转化及产物鉴定。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli C43(DE3) | 倍半萜氧化 | CYP264B1 | CYP264B1（细胞色素P450单加氧酶） | 催化 | 催化(+)-α-longipinene、(-)-isolongifolene和α-humulene的区域选择性氧化 |
| Escherichia coli C43(DE3) | 倍半萜氧化 | Adx4-108 | 截短的肾上腺皮质铁氧还蛋白（Adx4-108） | 能量供给 | 电子传递链中介体，将电子从AdR传递至CYP264B1 |
| Escherichia coli C43(DE3) | 倍半萜氧化 | AdR | 肾上腺皮质铁氧还蛋白还原酶（AdR） | 能量供给 | 催化NADPH氧化并将电子传递给Adx4-108；膜结合蛋白，在C43(DE3)中表达有效 |
| Escherichia coli C43(DE3) | 倍半萜氧化 | Fpr | 大肠杆菌铁氧还蛋白还原酶（Fpr） | 能量供给 | 用于对照系统的可溶性还原酶，与Adx4-108搭档，效率低于AdR |
关键发现
- 在铝箔包裹烧瓶中，使用HP-β-CD使(+)-α-longipinene的转化率从5.2%提高到57.1%（约25.1 mg/L）
- 在螺盖密封烧瓶中，转化率从47.8%提高到69.2%（约30.4 mg/L），相对提高44.8%。用AdR替代Fpr后，24小时产物产量从约29.8 mg/L提高到37.2 mg/L，提高24.8%。在200 mL规模、底物浓度300 μM下，(＋)-α-longipinene的主要产物12-羟基-α-longipinene产量为54.2 mg/L/天，转化率为82.1%
- (-)-isolongifolene的主要产物isolongifolene-9-one产量为34.2 mg/L/天，转化率为51.8%
- α-humulene的主要产物5-羟基-α-humulene产量为47.2 mg/L/天，转化率为71.5%。在底物浓度200 μM时，(+)-α-longipinene达到最高转化率94.7%。与先前系统相比，(+)-α-longipinene转化率总体提高了77.1%。
研究结论
通过使用HP-β-CD和替代氧化还原伴侣（AdR/Adx4-108），成功优化了基于CYP264B1的大肠杆菌全细胞系统，显著提高了三种倍半萜底物的氧化效率。产物经NMR鉴定为12-羟基-α-longipinene、isolongifolene-9-one和5-羟基-α-humulene。该系统为倍半萜含氧衍生物的绿色生物合成提供了高效平台，有望应用于制药、香料和食品工业。