Biosynthesis of Phenylglyoxylic Acid by LhDMDH, a Novel D-Mandelate Dehydrogenase with High Catalytic Activity
- 作者
- Cun-Duo Tang, Hong-Ling Shi, Jian-He Xu, Zhu-Jin Jiao, Fei Liu, Peng-Ju Ding, Hong-Fei Shi, Lun-Guang Yao, Yun-Chao Kan
- 单位
- Henan Provincial Engineering Laboratory of Insect Bio-reactor and Henan Key Laboratory of Ecological Security for Water Source Region of Mid-line of South-to-North, Nanyang Normal University; State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, East China University of Science and Technology
- 杂志
- J. Agric. Food Chem.（2018）
- DOI
- 10.1021/acs.jafc.7b05835
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
现有D-扁桃酸脱氢酶催化活性低，难以实现苯乙醛酸(PGA)的工业化生物合成；且传统辅酶再生需添加大量辅底物，成本高、效率低。
研究策略
通过基因组挖掘从哈尔滨乳杆菌中发现新型高活性NAD+依赖型D-扁桃酸脱氢酶LhDMDH，并在E. coli中异源表达；进一步构建共表达LhDMDH与LcLDH的双菌共培养全细胞催化体系，实现无需外加辅酶/辅底物的“一锅法”合成PGA。
核心内容
针对现有D-扁桃酸脱氢酶活性不足、辅酶再生依赖外加辅底物的瓶颈，研究者通过基因组挖掘，从哈尔滨乳杆菌中鉴定出一种新型NAD+依赖型D-扁桃酸脱氢酶LhDMDH，并在大肠杆菌中异源表达。该酶的比活力高达1200 U/mg，约为已知探针酶的4倍，kcat/Km为28.80 s⁻¹·mM⁻¹，显著优于现有酶，且对L-扁桃酸几乎无活性，展示出严格的立体选择性。为解决辅酶再生成本问题，构建了共表达LhDMDH与乳酸乳球菌L-乳酸脱氢酶LcLDH的双菌共培养全细胞催化体系，在不添加任何辅酶或辅底物的情况下，以50 mM D,L-扁桃酸为底物，48小时内PGA产率超过60%，产物纯度高于99%。该策略将D-扁桃酸氧化与丙酮酸还原偶联，实现内源NAD+循环再生，避免了传统路线中昂贵辅底物的添加。这项工作为外消旋扁桃酸的手性拆分及苯乙醛酸的绿色工业化生产提供了一种高效、经济可行的新方案。
创新点
1. 首次鉴定来自Lactobacillus harbinensis的新型D-扁桃酸脱氢酶LhDMDH，比活力高达1200 U/mg，约为已知探针酶的4倍；2. 构建双菌共培养系统，在不添加辅酶或辅底物条件下实现PGA高效合成，产率超过60%，纯度超过99%。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21 | D-扁桃酸氧化为苯乙醛酸 | LhDMDH (WP_027828400.1) | D-扁桃酸脱氢酶（2-脱氢泛解酸还原酶家族） | 催化 | 异源表达的新型高活性DMDH，比活力1200 U/mg |
| Escherichia coli BL21 | NAD+再生（丙酮酸还原为乳酸） | LcLDH (OJF74586) | L-乳酸脱氢酶 | 催化 | 促进NAD+再生，与LhDMDH共培养实现辅酶循环 |
| Lactobacillus harbinensis | D-扁桃酸代谢 | WP_027828400.1 | LhDMDH | 催化 | 基因来源菌，基因组挖掘获得 |
| Lactobacillus brevis | D-扁桃酸代谢 | LbMDDH (WP_011668914.1) | D-扁桃酸脱氢酶 | 催化 | 作为探针，用于基因组挖掘BLAST搜索 |
| Leuconostoc citreum | D-扁桃酸代谢 | LcDMDH | D-扁桃酸脱氢酶 | 催化 | 克隆的DMDH，比活力40.6 U/mg |
| Lactococcus lactis | D-扁桃酸代谢 | LIDMDH-2 | D-扁桃酸脱氢酶 | 催化 | 克隆的DMDH，比活力11.7 U/mg |
关键发现
- LhDMDH对D-扁桃酸的氧化活性约1200 U·mg^-1，接近探针的4倍
- kcat/Km为28.80 s^-1·mM^-1，显著高于探针的6.08
- 共培养E. coli BL21/pET28a-LhDMDH与E. coli BL21/pET28a-LcLDH，48 h内PGA产率超过60%，纯度高于99%
- 对50 mM D,L-扁桃酸，PGA产率约40%（理论产率50%）
- LhDMDH对D-扁桃酸Km=1.05 mM，kcat=30.28 s^-1，对NAD+ Km=0.40 mM，kcat/Km=72.00 s^-1·mM^-1
- 最适温度30°C，最适pH 9.5
- 对L-扁桃酸相对活性0.02%，对L-乳酸无活性。
研究结论
通过基因组挖掘获得了新型高活性D-扁桃酸脱氢酶LhDMDH，利用双菌共培养策略在不添加辅酶/辅底物条件下高效生物合成苯乙醛酸，为外消旋扁桃酸的手性拆分及PGA的绿色生产提供了可行策略。