Rewiring of the austinoid biosynthetic pathway in filamentous fungi
- 作者
- Derek J. Mattern, Vito Valiante, Fabian Horn, Lutz Petzke, Axel A. Brakhage
- 单位
- Department of Molecular and Applied Microbiology, Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology (HKI), Adolf-Reichwein-Str. 23, 07745 Jena, Germany; Friedrich Schiller University, 07745 Jena, Germany; Leibniz Research Group - Biobricks of Microbial Natural Product Syntheses, Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology (HKI), Adolf-Reichwein-Str. 23, 07745 Jena, Germany; Systems Biology and Bioinformatics, Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology (HKI), Adolf-Reichwein-Str. 23, 07745 Jena, Germany; GFZ German Center for Geosciences, Section 5.3 Geomicrobiology, Telegrafenberg, 14471 Potsdam, Germany; BASF SE, 67056 Ludwigshafen, Germany
- 杂志
- ACS Chemical Biology（2017）
- DOI
- 10.1021/acschembio.7b00814
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
不同真菌中austinoid生物合成基因簇重排导致化学产物多样性，且天然生产菌A. calidoustus仅在不利于工业的静态培养条件下产生最多种类衍生物，如何在工业友好的浮游生长条件下重构并生产具有杀虫活性的austinoid衍生物
研究策略
通过比较基因组学分析A. calidoustus、A. nidulans和P. brasilianum中austinoid基因簇的差异，然后在模式菌A. nidulans中异源表达来自A. calidoustus的缺失基因（ausP、ausT、ausV、ausO），利用宿主内残留的同源基因（ausQ/AN9250、ausR/AN9251），结合多顺反子表达技术（2A肽）实现通路的逐步重构与产物生产
核心内容
本研究通过比较基因组学分析了A. calidoustus、A. nidulans和P. brasilianum三种远缘真菌中austinoid生物合成基因簇的重排与基因丢失现象，发现A. calidoustus的基因簇位于66 kb连续DNA区域，而另外两种真菌的基因簇被拆分且存在倒位。在模式菌A. nidulans中，作者利用宿主内先前认为无功能的残留同源基因ausQ和ausR，通过2A肽多顺反子表达技术逐步引入来自A. calidoustus的缺失基因ausP、ausT、ausV和ausO，实现了通路重构。异源表达ausP后，A. nidulans在浮游培养条件下即可产生包括austin 2和dehydroaustin 3在内的多种衍生物；仅添加ausV共表达产生1,2-dehydro-precalidodehydroaustin 13，而ausP+ausT+ausV共表达产生precalidodehydroaustin 6。最终，ausP+ausO+ausT+ausV完整组合在静态培养中产生终产物calidodehydroaustin 7。值得注意的是，最活跃的杀虫活性衍生物dehydroaustin 3得以在工业更友好的浮游生长条件下生产，且引入ausP后宿主的残留基因功能得以显现。该研究证明相似但不完全相同的基因簇蕴含化学可塑性，比较基因组学可用于挖掘已知代谢途径的全部潜力。
创新点
揭示三种远缘真菌中austinoid基因簇的重排与基因丢失；利用A. nidulans中先前认为无功能的残留同源基因（ausQ、ausR），在引入ausP后使其恢复功能；通过2A肽多顺反子表达实现单启动子驱动多基因共表达；首次在浮游生长条件下实现活性化合物dehydroaustin 3的生产
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Aspergillus calidoustus | austinoid 生物合成 | ausA | 聚酮合酶 AusA | 催化 | PKS，负责聚酮骨架合成；作为基因组挖掘探针 |
| Aspergillus calidoustus | austinoid 生物合成 | ausE | 非血红素铁依赖双加氧酶 AusE | 催化 | 催化 preaustinoid A 转化为关键中间体；同源蛋白在 A. nidulans 和 P. brasilianum 中均存在 |
| Aspergillus calidoustus | austinoid 生物合成 | ausP | O-乙酰转移酶 AusP | 催化 | 异源表达于 A. nidulans，使其在浮游培养中产生 austin 2、dehydroaustin 3 等 |
| Aspergillus calidoustus | austinoid 生物合成 | ausT | 孕酮 5β-还原酶样蛋白 AusT | 催化 | 与 ausP 共表达产生 1,2-dihydro-7-hydroxydehydroaustin 5；需静态培养才可检测 |
| Aspergillus calidoustus | austinoid 生物合成 | ausV | 非迭代聚酮合酶/二酮合酶 AusV | 催化 | 与 ausP 共表达产生 1,2-dehydro-precalidodehydroaustin 13；A. nidulans 和 P. brasilianum 中仅有 ~80% 相似性的假基因 |
| Aspergillus calidoustus | austinoid 生物合成 | ausO | 双加氧酶 AusO | 催化 | 与 ausP、ausT、ausV 共表达产生终产物 calidodehydroaustin 7 |
| Aspergillus nidulans | austinoid 生物合成 | ausQ（AN9250） | O-酰基转移酶 AusQ | 催化 | 原本缺失无表型，引入 ausP 后恢复功能，参与生成 7-hydroxydehydroaustin 4 和 acetoxydehydroaustin 10 |
| Aspergillus nidulans | austinoid 生物合成 | ausR（AN9251） | 细胞色素 P450 单加氧酶 AusR | 催化 | 同 ausQ，在 ausP 存在时发挥功能，催化后续氧化步骤 |
| Aspergillus nidulans | austinoid 生物合成 | ausE | 双加氧酶 AusE | 催化 | 内源基因，参与前期 austinoid 合成，产生 austinol 1 和 dehydroaustinol 8 |
| Penicillium brasilianum | austinoid 生物合成 | prhA | PrhA 双加氧酶 | 催化 | AusE 同源物，催化 berkeleydione 形成，导向 paraherquonin 分支 |
关键发现
- A. calidoustus的austinoid基因簇位于66 kb连续DNA区域，而A. nidulans和P. brasilianum的簇被拆分且存在基因倒位；A. nidulans和P. brasilianum中残留的ausV假基因与A. calidoustus的ausV序列相似性约80%。异源表达ausP后，A. nidulans在浮游培养中产生austin 2 (m/z
- 21)、dehydroaustin 3 (m/z
- 19)、7-hydroxydehydroaustin 4 (m/z
- 19)和acetoxydehydroaustin 10 (m/z
- 20)。表达ausP+ausT产生1,2-dihydro-7-hydroxydehydroaustin 5 (m/z
- 20)及分流产物10和1,2-dihydro-acetoxydehydroaustin 11 (m/z
- 21)。仅添加ausV与ausP共表达产生1,2-dehydro-precalidodehydroaustin 13 (m/z
- 23)。ausP+ausT+ausV共表达产生precalidodehydroaustin 6 (m/z
- 24)。ausP+ausO+ausT+ausV共表达在静态培养中产生终产物calidodehydroaustin 7 (m/z
- 24)。最活跃的衍生物dehydroaustin 3可在浮游生长条件下生产。A. nidulans中ausQ（AN9250）和ausR（AN9251）基因缺失时无表型，但引入ausP后其功能得以显现。
研究结论
通过比较基因组学和合成生物学工具，在A. nidulans中成功重构了完整的austinoid生物合成通路，实现了在工业更有利的浮游生长条件下生产最活跃的衍生物dehydroaustin 3。研究证明，不同微生物物种中相似但不完全相同的基因簇蕴含着化学可塑性，比较基因组学可应用于挖掘已知代谢途径的全部潜力。